丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

梁化亮

（生物与食品工程学院，常熟 215500）

Progress on antimicrobial peptide

[摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。

[关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御

1 丝氨酸蛋白酶抑制剂

免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。

丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。

1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类

目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。

1.2 Serpins

Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为

350-500个，具有保守的空间结构。Serpins多为单一肽链蛋白，其肽链结构可表示为N端－P15～P9～P1～P1，～P9～P15－C端，Pl是被靶酶中的底物识别位点识别的氨基酸[7]。距C端30－40个氨基酸部位含有RCL(reactive central loop)，RCL暴露于蛋白表面，是serpins与目的蛋白相互作用的部位。Serpins 最开始被认为起源于原核组织，但是到目前为止已经在许多细菌和太古代的生物中发现[8-10]。但是这些原核生物的基因是否为原核serpins或侧生基因转移产物的祖先还尚不得而知。

1.2.1 Serpins的结构

结构生物学对于我们理解serpins的结构和功能起着重要作用。至今为止超过80种serpins结构具有不同构象，尽管serpins结构多变，但是无论是无抑制活性的卵清蛋白（ovalbumin）或有活性的抗胰蛋白酶（antitrypsin）却有着一些共同结构[11-12]。典型的serpins如antitrypsin和ovalbumin都拥有3个β－片层（命名为A，B，C）和8－9个α－螺旋（hA－hI）。Serpins还有一个反应活性环（RCL），它是一个凸出的，延伸的，暴露的环，它与蛋白酶凹陷的反应位点高度互补，是抑制剂与目的蛋白相互作用的部位。二者的结合方式与酶与底物的作用方式相似。RCL的氨基酸顺序决定了抑制剂的选择性。改变RCL的氨基酸顺序，尤其是Pl位点的氨基酸，也就改变了该抑制剂的蛋白酶选择性。多数Serpins的P1部位均为精氨酸，并且他们能抑制不同的丝氨酸蛋白酶。RCL易被靶酶之外的蛋白酶切除．比较不同Serpins的氨基酸顺序发现：虽然典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂的同一个家族成员中，氨基酸序列呈现出高度的多样性，但RCL 的主链构象却很相似，即RCL及其相邻部位的几个氨基酸顺序在该家族中是保守的。即使在不同家族中也一样，在同酶形成复合物后，RCL的主链构象就更加相似了[13-14]。

Serpins能以多种结构稳定存在[15]：

(1)与靶酶作用之前的结构。与卵清蛋白等其它晶体结构类似，含有五条A B －折叠链和一个RCL螺旋区；

(2)RCL被剪切的serpin，其铰链区与RCL镶嵌于A－折叠；

(3)C－折叠解离出l链，使得铰链区及RCL在无键断裂的情况下可以完全插入到A－折叠片段中(如PAI－2、抗凝血酶等)：

(4)抗凝血酶的部分铰链区插入于左折叠。

除此之外，最为重要的是与酶形成复合物时的Serpin结构。非功能性抑制子(卵清蛋白)和潜伏性抑制子(PAI－1)的RCL构型表现出两种极端的状态，卵清蛋白的S4链不插入A折叠，而PAI－1的RCL全部镶嵌到A一折叠中。然而，这两种具有极端结构的Serpin均不能抑制蛋白酶。对抗凝血蛋白酶、肝素共价因子Ⅱ、MENT、鼠类抗胰蛋白酶等抑制剂与靶酶的复合物进行X－射线晶体结构分析，发现RCL环的前两个氨基酸会插入顶部A－折叠中。这种部分插入的构象由于能使得共价因子更方便地结合并插入serpins中，进行完全暴露的形态转化[16-17]，因子它对于serpins是否具有抑制活性起到了关键作用。

1.2.2 Serpins的作用机制

在二十世纪七十年代术期，研究者们认为：serpins与其它蛋白酶抑制剂不同，它与靶酶以共价酯键相结合。然而，这是通过分析SDS－PAGE中的变性复合物而不考虑其天然条件下的复合物得出的结论。后来的研究认为：天然的Serpin/Protease复合物是可逆的，因此二者不可能是共价结合，它不同于锁钥构型，而是与Kunitz，Kazal型等小分子类抑制剂相似，很可能是形成米氏复合物[18]。

目前认为Serpin与其靶酶的作用方式有两种[19]：“底物”途径和“自杀”途径。大部分serpins是以“底物”途径与靶酶进行相互作用。在“底物”途径中，Serpins与靶酶形成共价复合物[20]。Serpins结构研究表明复合物形成期间，会发生构型转化（紧密型－松散型）[21-24]，即RCL环插入β－片层A中形成一个额外的第四股β束，这种构象变化对于serpins对靶酶的抑制作用相当重要。酶(E)与抑制剂(I)先以氢键形成米氏复合物(EI)，然后再转换成亚稳态结构（EIt），然后丝氨酸蛋白酶抑制剂P1部位氨基酸的梭基与靶酶丝氨酸蛋白酶的梭基之间形成酯键，继而转换成脂酰基复合物(EI*)，最后通过第二个复合物(EIt*)生成被剪切的抑制剂(I*)和仍有活性的酶（E）。

上述可表示为：E+I EI 【EIt】 EI* EIt* E+I* 第二种为“自杀”途径。Serpin通过自杀性底物的作用机制与酶发生不可逆的反应。酶最初与抑制剂的剪切位点P1-P1’两侧的残其相互作用，形成非共价的米氏复合物，然后剪切位点键攻击酶活性位点丝氨酸，导致酶Ser195及P1位点羰基之间形成共价酯键，并且P1位点被剪切[25]。在“自杀”途径中，Serpin 的剪切比较缓慢，因此在Serpin发生剪切之前，Serpin/Protease复合物已经