三引物法鉴定T
拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应
拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应赵彦敏;高海琴;瓮巧云【摘要】采用PCR和RT-PCR技术分别在DNA和RNA水平上对由于T-DNA 插入所导致的拟南芥ABI3基因突变体进行鉴定,鉴定后将野生型Col-0与纯合abi3突变体种子分别置于含不同浓度NaCl的MS培养基上培养,测定萌发率、生物量和根长.结果表明:在NaCl胁迫下,野生型Col-0和纯合abi3突变体种子的萌发率、生物量和根长均随着NaCl浓度的增加呈现下降趋势.在相同NaCl浓度下,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均低于野生型Col-0.当NaCl浓度达到150 mmol/L时,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均降到最低,与野生型Col-0存在极显著差异.可见,拟南芥ABI3基因具有提高拟南芥抗NaCl 胁迫能力的作用.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P7-10)【关键词】ABI3基因;T-DNA插入;突变体;NaCl胁迫【作者】赵彦敏;高海琴;瓮巧云【作者单位】张家口广播电视大学,张家口075000;张家口广播电视大学,张家口075000;河北北方学院农林科技学院,张家口075000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2植物在生长发育过程中,不可避免地会受到各种非生物因素如干旱、低温、高盐及高温等的胁迫,导致农作物的生长品质及产量下降。
作为植物体内重要的逆境响应激素之一,脱落酸(Abscisic acid,ABA)既是胁迫的诱导产物,又是胁迫信号的传导者,通过级联放大反应,能迅速参与到植物抗胁迫的反应中。
此外,脱落酸还参与植物生长的其他环节,如能促使马铃薯形成块茎、抑制种子的萌发等。
早期通过正向遗传学方法筛选到一些在萌发率上对 ABA不敏感的拟南芥基因,如 ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作为ABA信号的正调控转录因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐盐性功能中起重要的作用[5],主要在种子里表达[2]。
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理〔图〕。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。
用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
T-DNA插入鉴定实验报告
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
生物技术本科毕业论文pcr方法在apoe基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用
湖北中医药大学本科生毕业论文题目：PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用姓名：学号：专业：生物技术年级：2008级实习单位：武汉大学心血管病研究所指导老师：完成日期：2012 年5 月1 日PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用作者肖明瑶指导者张艳摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。
方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。
结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。
用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。
结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。
关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白EGenotype identification of ApoE Gene Knockout Mice withPolymerase Chain ReactionObjective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice.Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化(atl-rosclerosis，AS)病灶形成。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
PCR的条件和注意事项
PCR的条件和注意事项PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR 反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。
在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。
下面就各种温度的选择作一介绍。
1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。
变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。
一般取90～95℃。
样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。
DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA 聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
pcr扩增后t载体
pcr扩增后t载体PCR扩增后的T载体是一种常用的分子生物学工具，用于在实验室中进行DNA片段的克隆和基因的表达研究。
本文将详细介绍PCR扩增后T载体的概念、构建方法以及在科研中的应用。
一、PCR扩增后T载体的概念PCR扩增后T载体是一种用于克隆PCR产物的载体，它通过连接PCR扩增产物的末端与T载体的末端序列相互匹配，实现PCR产物的快速克隆。
PCR扩增后的T载体通常包含T载体的启动子和选择标记，方便后续对克隆产物的筛选和表达。
二、PCR扩增后T载体的构建方法PCR扩增后T载体的构建通常包括以下几个步骤：1.设计引物首先根据需要克隆的PCR产物设计引物，使其在扩增产物的末端含有T载体的末端序列。
T载体的末端序列通常为5'-AATTGGGAAAA-3'。
2.进行PCR扩增使用设计好的引物进行PCR扩增，获取所需的DNA片段。
在PCR反应中，可以根据需要添加引物的Pfu酶切位点，便于后续的克隆步骤。
3.准备PCR产物将PCR产物进行电泳检测，确认目标片段的大小和纯度。
如有必要，可进行片段纯化和测序验证。
4.连接T载体序列将PCR产物与线性化的T载体进行连接。
连接反应中，需将PCR产物和T载体按一定比例混合，加入连接酶和缓冲液，进行高效连接。
5.转化宿主细胞将连接产物与宿主细胞（如大肠杆菌）进行转化。
转化后，将转化产物接种到含有选择抗生素的琼脂平板上，筛选并培养阳性克隆。
6.验证克隆基因通过PCR或限制酶切等方法验证克隆基因的存在，并进行测序分析。
确保克隆基因的准确性和完整性。
三、PCR扩增后T载体的应用PCR扩增后的T载体在科研中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因克隆通过PCR扩增后T载体的使用，可以高效地克隆和表达目标基因。
这为基因功能研究和蛋白质表达提供了方便和快捷的工具。
2.基因组库构建PCR扩增后T载体可以用于构建基因组文库，提供了大规模筛选和鉴定目标基因的手段。
2023届河南省部分学校高三下学期押题信息卷(一)理综生物试题(含答案解析)
2023届河南省部分学校高三下学期押题信息卷（一）理综生物试题学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________一、单选题1．酵母菌sec系列基因的突变会影响分泌蛋白的分泌过程。
B型突变酵母菌的分泌蛋白积累在内质网中，D型突变酵母菌的分泌蛋白则积累在高尔基体中。
下列相关叙述正确的是（）A．分泌蛋白在核糖体上合成时伴随着放能反应B．突变酵母菌B型的内质网和D型的高尔基体均可能无法形成正常囊泡C．DNA聚合酶、胰高血糖素的合成均需内质网和高尔基体参与加工D．内质网和高尔基体都是具有双层膜的细胞器，均属于生物膜系统2．紫色洋葱鳞片叶是高中生物学实验常用的实验材料。
某同学将紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞放入大于细胞液浓度的KNO3溶液中观察其质壁分离与复原。
下列相关叙述错误．．的是（）A．该实验的结构基础是细胞膜、液泡及细胞质形成的原生质层B．该实验还可以说明细胞膜与细胞壁在物质透过性上存在差异C．自动复原后，洋葱鳞片叶外表皮细胞还可能继续从KNO3溶液中吸收水分D．一段时间后KNO3溶液中的细胞未发生质壁分离，并不能说明细胞已死亡3．“白肺”是指在X光检查下肺部呈现大片白色显影。
出现“白肺”一般意味着肺部有严重感染，症状一旦出现，患者可能因呼吸衰竭而死亡。
下列相关叙述正确的是（）A．“白肺”患者肺部细胞只进行无氧呼吸，从而导致呼吸衰竭B．与正常人相比，“白肺”患者O2消耗量/CO2产生量的值降低C．“白肺”患者细胞中的葡萄糖进入线粒体并被分解的能力减弱D．“白肺”患者细胞中产生的[H]可与O2结合生成H2O并释放能量4．减数分裂过程中同源染色体间形成联会复合体（受联会复合体基因ZEP1控制）完成配对，而且同源染色体的非姐妹染色单体之间进行局部交换和出现交叉点。
最新研究发现，水稻的联会复合体基因ZEP1突变体仍能完成减数分裂，但在该突变体中1对同源染色体平均存在7个交叉点，而野生型平均存在约2个交叉点。
烟草突变体筛选与鉴定方法篇：3.烟草突变体的TILLING筛选与功能鉴定
特点。随着烟草全基 因组测序的完成 ，ＴＬ Ｉ Ｇ在烟草功能基 因组学中的重要价值也越发体现 出来 。 ＩＬ Ｎ
选 技术 如 毛细管 电泳（ ａｉａ ｅｔ ｐ ｏｅｉ， Ｅ）聚丙 烯酰 胺凝 胶 电泳（ ｏｙｃｙａ ｄ ｅｅｅｔ ｐ ｏｅｉ ｃｐｌｒ ｅ ｃ ｏｈ ｒｓｓＣ 、 ｌｙ ｌ ｒ ｐ ｌａｒｌｍｉｅｇｌｌ ｒ ｈｒｓ ， ｃｏ ｓ
Ｐ Ｇ 、琼脂糖 电泳 （ ｇｒｓ ｇｌｌ ｔ ｐ ｏ ｓ ， Ｇ 、高分辨熔解 曲线 （ ｉ ｒｓｌ ｉ ｅ ｉ ， Ｒ ） Ａ Ｅ） ａａ ｅ ｅｅ ｃ ｏｈ ｒ ｉ Ａ Ｅ） ｏ ｅ ｒ ｅｓ ｈ － ｏ ｔ ｎ ｌ ｇＨ Ｍ ｅ ｕｏ ｍ ｔ ｎ
链核酸分子 ；（ ）电泳检测 ，检测手段可通过产生真实 电泳图谱 的 ＬＣ Ｒ ３０遗传分析工作站进行 ，也 ４ ＩＯ ４０
可通过 自动 化程 度较 高 的毛细管 电泳 系统 进行 ；（ ５）采取 相 同 的方 法从 突变 池 中筛选 突变 个体 ；（ ）突变 ６
个体 Ｐ Ｒ产物的测序验证。 Ｃ
高水平 的突变剂量 ，多倍体的突变频率要显著高于二倍体 ，如二倍体植物拟南芥、水稻 、玉米的突变频率
分别为 １ ７ 、１ ０ ｂ ／ ５ ｂ 而多倍体植物普通小麦突变频率 １ ４ ｂ 普通烟草约为 １ ６ ｂ 因 ／ ０ ｂ ／ ０ 、１ ８ ， １ ｋ ５ ｋ ４ ｋ ／ ， ２ｋ ／ ， ６ｋ
此要使基因组中 ９％以上 的基 因都有突变信息 ，多倍体植物如普通小麦 ＴＬ Ｉ Ｇ检测群体很少超过 ５０ ５ ＩＬ Ｎ ００
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：我们用CTAB法提取拟南芥的T-DNA插入突变体的DNA，然后用三引物法进行PCR和琼脂糖凝胶电泳来判断其为突变纯合体还是突变杂合体。
通过这次实验，我们掌握了如何来判断纯和突变和杂合突变。
关键字：拟南芥 T-DNA插入突变突变体的鉴定前言：拟南芥拟南芥是十字花科的植物，它是植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物，其具有以下这些特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右；②生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；③种子多，每株可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤遗传转化简单，转化效率高；⑥基因组小，只有5对染色体，125MB；⑦在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
突变体突变体在植物基因分离及遗传学研究的最重要材料，通过自然突变或者人工诱变同源重组、基因沉默以及插入突变等方法都可以用来构建突变体，人工诱变是指利用物理因素（X射线，Y射线，紫外线，激光等）或化学诱变(如亚硝酸，硫酸二乙酯）来处理生物，使生物发生基因突变，这种方法可提高突变率，创造人类需要的变异类型。
目前，人工诱变拟南芥常用的方法有EMS诱变、T-DNA 插入突变、激活标签等。
T-DNA插入突变Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库，在此基础上构建侧翼序列库；目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的T—DNA插入突变体库，该突变体库包含超过225 000个独立的T—DNA插入株系，在预测的29 454个基因中有21 700个基因发生了插入突变[6]。
PCR技术简介(1)
分子生物学概论 ‐‐ PCR技术简介前言一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。
因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。
这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)‐‐聚合酶链式反应具有的特色之一。
这也是分子生物医学令人震撼的一例。
何谓PCR简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。
基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
PCR的要素基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。
PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。
所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。
最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq‐polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。
PCR的历史PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。
DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。
t-DNA鉴定1
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• DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入 DNA经溴乙锭（EB）染色， 经溴乙锭 DNA双螺旋结构两个碱基之间 双螺旋结构两个碱基之间， DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成 络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下， 络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下， 产生桔黄色荧光（ nm可见光 可见光）。 产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。
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• 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 PCR
• LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物 LP和RP是植物基因组上 DNA插入位点两测的引物 是植物基因组上T • BP是T-DNA区段上的引物 BP是 DNA区段上的引物
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PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成： 由变性--退火 延伸三个基本反应步骤构成： 由变性 退火--延伸三个基本反应步骤构成
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步骤
• 1.用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离 1.用液氮将100 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 用液氮将 心管中加入预热至65℃ 65℃的 CTAB提取液 提取液， 心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻 摇混匀。 摇混匀。 • 2.65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 2.65℃水浴 水浴30 min，其间轻摇混匀。 • 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24： ），室温下 向上清液加入等体积的氯仿 轻轻混匀10 min， rpm离心 离心15 min， 轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入 新管。 新管。 • 4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 4.向上清液中 倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 向上清液中2 rpm离心 离心15 min，弃上清。 -20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 • 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次 乙醇洗涤沉淀一次， rpm稍离心 弃上清。 稍离心， • 6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 6.将沉淀晾干 将沉淀晾干， 208.0)， 65℃水浴 水浴30 min溶解DNA。 溶解DNA min溶解DNA。 • 7. 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓 度和质量。
拟南芥
姓名沈一鸣班级生技3班同组人无科目遗传学实验题目拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定组别无—————————————————————————————————————————————————————一、实验目的1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异；2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）：十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物拟南芥特点：1)植株形态个体小，高度只有30cm左右；2)生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；3)种子多，每株可产生数千粒种子；4)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；5)遗传转化简单，转化效率高；6)基因组小，只有5对染色体，125MB；7)在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物突变体是遗传学研究的最重要材料。
自然突变突变体的获得人工诱变拟南芥诱变常用方法：EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
T-DNA插入突变原理：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA（transferred DNA ）。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立
猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立郑新添;杨小燕;戴爱玲;李晓华;陈星星【摘要】通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及猪轮状病毒（RV）的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。
该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明：建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。
%Three pairs of primers amplified genes of transmissible gastroenteritis virus（TGEV）,porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and porcine rotavirus（RV） respectively were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV,PEDV and RV.The established PCR can detect M gene with the length of 252bp of TGEV,N gene with the length of 540 bp of PEDV and VP7 gene with the length of 412 bp of RV.Negative results when using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 100-pg nucleotide per PCR reaction.Twenty six diarrheal fecal samples collected from viral diarrheal piglet were submitted to detect TGEV,PEDV and RV,and the result showed that this multiplex RT-PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity can be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.【期刊名称】《龙岩学院学报》【年(卷),期】2011(029)005【总页数】4页(P55-58)【关键词】猪传染性胃肠炎;猪流行性腹泻;猪轮状病毒;多重PCR;诊断【作者】郑新添;杨小燕;戴爱玲;李晓华;陈星星【作者单位】龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心,福建龙岩364012【正文语种】中文【中图分类】S858.28猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE），猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）及猪轮状病毒（Porcine rotavirus，RV）感染，是猪场常见的病毒性腹泻，此三种病毒性腹泻造成了猪场饲料报酬降低、药物和人力增加等重大损失，是危害猪场最严重的疾病之一[1-2]。
TAILPCR技术简介
2012-09-22 中南民族大学 生命科学学院
吴俊杰
• 一.TAILPCR技术原理 • 二.TAILPCR实验操作 流程 • 三.TAILPCR注意事项 • 四.TAILPCR应用
• 一.原理：热不对称性PCR (thermal
asymmetric interlaced PCR, 简称TAILPCR) ，是利用目标序列旁的已知序列设计3个 嵌套的特异性引物(special prime ,简称 sp1 ,sp2 ,sp3 ) ,用它们分别和1个具有低Tm值 的短的随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD)相组合,以基因组DNA作为模 板, 通过3轮具热不对称的温度循环的分级反 应来进行PCR扩增，从而获得已知序列旁的侧 翼序列。
•
•
谢谢
并引物相对较短 ,长度为 14 bp , Tm 为 30～48 ℃。
特异引物与随机引物Tm值要求至少相差10度以上。特 异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如
果不能获得满意的扩增结果 ,则应该在预备实验中重
新设计特异性引物或者换用其它的简并引物。
• 2.TAIL PCR 的引物浓度：为减少错 配，特异引物应保持较低浓度；而 简 并引物的浓度要高，一般为 2 .5 ～ 5 .0pmol/ μ L ，以满足引物的结合效 率。
• 4.三次TAILPCR反应：
• 第 1 次PCR反应由 5 次高特异性反应、 1 次低特异性反 应、 10 次较低特异性反应和 12 次热不对称的超级循 环构成。通过 5 次高特异性的反应 ,使 sp1 与已知的序 列(载体或 T-DNA 等)退火并延伸 ,异引物 SPl 与已知 的序列退火并延伸，目标序列扩增成直线性型上升，1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列 上 ,接下来 10 次较低特异性的反应使两种引物均能与 模板退火 ,从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶 DNA复制成双链DNA.最后是进行12次热不对称的 TAIL循环(超级循环即高特异性和低特异性循环交替)， 目的片段得以指数性地扩增。
三引物法鉴定T
三引物法鉴定T-DNA插入突变体：三引物法的原理下图所示，即采用三引物(LP、RP、BP)进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约1100 bp (即从LP到RP)；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25 kb，过长的模板会阻止目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为560-860bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。
双引物法的基本原理与三引物法相似，只是需要急性两轮PCR扩增。
一组以基因组DNA特异引物LP和RP扩增目的基因片段；另一组以T-DNA 的特异引物BP与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段。
此法的不足之处是完成最终鉴定需进行两轮PCR扩增。
由于三引物法容易导致PCR反应体系的引物浓度过高，形成引物二聚体或形成非特异性扩增，导致结果不理想，所以采用二引物法进行实验。
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三引物法鉴定T-DNA插入突变体：三引物法的原理下图所示，即采用三引物(LP、RP、BP)进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约1100 bp (即从LP到RP)；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25 kb，过长的模板会阻止目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为560-860bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。
双引物法的基本原理与三引物法相似，只是需要急性两轮PCR扩增。
一组以基因组DNA特异引物LP和RP扩增目的基因片段；另一组以T-DNA 的特异引物BP与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段。
此法的不足之处是完成最终鉴定需进行两轮PCR扩增。
由于三引物法容易导致PCR反应体系的引物浓度过高，形成引物二聚体或形成非特异性扩增，导致结果不理想，所以采用二引物法进行实验。