13(1).细胞培养中出现小颗粒的原因1

细胞培养的过程中，经常见到黑色的颗粒或小黑点，已成为很多细胞培养初学者的困扰，这种情况是怎么引起的呢？该如何避免呢？

产生原因：

1.细胞状态：细胞自身具有分泌功能，或细胞营养不良，生长状态欠佳，细胞老化都有可能在培养过程中出现小黑点。

2.血清沉淀：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖。一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长，但若经过平行试验怀疑此血清的品质，应立即停用，更换另一批号的血清。

3：黑胶虫污染

黑胶虫概况：在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动（类似布朗运动）,这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现）,目前业内人士称其为“黑胶虫”.黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑.黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm 滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物.如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡.不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：

①与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响.

②“黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”.

③“黑胶虫”与血清有关,与血清质量有一定关系.

4：支原体污染：如果细胞表面出现许多小黑点，细胞生长缓慢，培养液很黄，那么支原体污染的可能性就很大。

5：细胞受各种霉菌、细菌等生物污染。此种原因大多为环境原因造成。解决办法：

1.如果小黑点有增殖趋势，那么就有可能是污染了，需要处理；如果确定是支原体解决办法很多：

a 抗生素(antibiotic)除菌法：用抗生素抑制支原体。取受支原体污染的细胞，加入含抗生素的1640培养液培养3天后，吸除培养液连续三个轮回。清除支原体后的细胞，在不加抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。

b 加温除菌法：把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。

c 动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物

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免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

d巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。

消除支原体很麻烦，如果有库存的细胞，可以将状态不好的细胞弃去，重新复苏一个。2.如果小黑点没有增殖趋势，且不影响细胞生长，也不影响实验的话，则可能

是黑胶虫，黑胶虫与细胞竞争性生长，细胞增长速度快时即可抑制其生长。

3.小黑点没有增殖趋势也可能是细胞碎片，或血清里德沉淀析出或杂质，在做布朗运动。此情况及时更换培养液即可。

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