蛋白检测-免疫共沉淀(Co-IP)

主题：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）

概述：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种以抗体和抗原之间的特异免疫反应为基础，研究蛋白质与蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入抗原特异性的抗体，抗体、抗原、以及与抗原具有相互作用的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物，经过纯化，洗脱，收集免疫复合物，SDS-PAGE电泳，western blot和（或）质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

目的：

研究一种已知蛋白质与已知或者未知蛋白质间相互作用

原理：

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合

的蛋白质Y也能沉淀下来。

步骤：

1.用RIPA裂解缓冲液裂解细胞；

2.用PBS配制成50%的protein A/G-agarose工作液；

3.在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G agarose工作液。水平摇床4℃摇动10min（该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白）；

4.4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除protein A/G-agraose微球；

5.使用BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度；

6.加入一定体积的一抗；

8.用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜；

9.14000g离心收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的PBS）洗涤3遍；

10.收集上清，用于进一步的下游SDS-PAGE、western-blot或者质谱分析。流程图：