1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个

1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之

间,且一个

1.荧光共振能量转移

原理

如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。

优点

1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,

2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,

3.准确度高，操作简便

4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,

缺点

首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;

其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;

另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。

2.蛋白质双杂交技术

原理

以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱

饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

酵母双杂交系统的优点及局限

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA －结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道

基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统在分析蛋白—蛋白间相互作时的优点:

（1）检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。

（2）作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

(3) 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

(4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

(5)分析新基因的生物学功能，用未知功能的基因去筛选文库，然

后根据钓到的已知基因的功能推测新基因的功能。

缺点

(1) 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行。

(2) 酵母双杂交系统的“假阴性”

(3) 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。

3.噬菌体展示技术

原理

噬菌体展示技术是利用基因工程手段将合成的一组一定长度的

随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中, 使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面。进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。

优点

不受样品量限制，可人工扩增，类似PCR对DNA的扩增

融合目的蛋白的噬菌体被分泌出胞外，免去了细胞破碎、提纯等物理化学步骤，保持了蛋白的天然构象

可进行反复筛选，对目的蛋白进行春花和富集

缺点

由于受大肠杆菌转化效率的限制, 一般肽库的容量只有109, 所以高于这一限制的基因将难以表达。

从建库开始, 密码子的选择与寡核苷酸的合成, 即编码肽的基因就带有一定的偏爱性, 这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。

作为噬菌体的宿主, 大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制, 如不能进行氨基酸的修饰。

4.蛋白质的亲和色谱

原理

色谱又叫层析。亲和层析属于吸附层析的范畴，根据不同物质在同一吸附剂上的吸附能力不同进行分离，将样品放入基质中，经展开，吸附能力差的迁移快，吸附能力强的迁移慢，达到分离的目的。

优点

利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质,不但能可以用来分离一些含量极微的物质,而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。

缺点

载体(如琼脂糖)价格昂贵,机械强度低;配基制备困难,有的配基本身需要分离纯化，步骤繁琐。

5.亲和印迹

原理

印迹法（bloting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后利用这种多肽的特异抗体来检测。

优点

高分辨率的电泳技术，特异敏感的抗原-抗体反应，1-5ng中等大小的靶蛋白

缺点

易产生背景太高的原因等问题