荧光共振能量转移
简述荧光共振能量转移技术
简述荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术（FRET）是一种通过荧光信号的传递来研究分子间相互作用的技术。
它基于荧光分子的特性，利用分子间的能量传递来研究化学和生物学系统中的相互作用。
荧光共振能量转移是一种非辐射能量传递的过程，它发生在足够靠近的两个荧光分子之间。
这两个分子分别称为给体和受体。
给体的激发态能量可以通过FRET传递给受体，从而使受体从基态跃迁到激发态。
这一过程在分子间的距离较近时才能发生，一般要求距离在1-10纳米范围内。
通过测量受体的荧光强度变化，可以获得有关给体和受体之间相互作用的信息。
在FRET过程中，给体和受体的选择非常重要。
给体的荧光发射波长应与受体的吸收波长相匹配，以确保能量传递的有效性。
常用的给体-受体组合包括荧光蛋白-荧光蛋白、荧光染料-荧光蛋白、荧光染料-金纳米颗粒等。
FRET技术在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，通过将荧光蛋白标记在感兴趣的蛋白质上，可以研究蛋白质的定位、结构和功能。
通过观察荧光信号的变化，可以了解蛋白质与其他分子的相互作用、结合和解离过程。
此外，FRET还可以用于研究细胞和组织中的信号传导、代谢过程等。
除了生物学研究，FRET技术也在化学、材料科学等领域得到了应用。
例如，通过合成特定结构的荧光分子，可以实现对分子间相互作用的精确控制和检测。
这对于研究分子的自组装、聚集行为以及材料的光学性质具有重要意义。
FRET技术的发展受到了许多因素的影响。
首先，荧光分子的性质和性能对FRET的效果有着重要影响。
选择合适的荧光分子对于获得准确的结果至关重要。
此外，实验条件的控制也是关键因素。
温度、溶剂、pH值等因素都可能影响FRET的效果，因此需要进行严格的实验控制和优化。
荧光共振能量转移技术是一种用于研究分子间相互作用的强大工具。
通过测量荧光信号的传递，可以获得有关分子结构、相互作用和功能的重要信息。
FRET技术在生物学、化学和材料科学等领域具有广泛的应用前景，将为我们深入了解分子世界提供更多的可能性。
1荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个
1.荧光共振能量转移如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。
这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。
1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,3.准确度高，操作简便4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。
这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
荧光共振能量转移FERT
动生物医学研究的发展。
人工智能和机器学习在FERT数据分析中应用
数据处理和分析自
动化
利用人工智能和机器学习技术， 实现FERT数据的自动处理和分析， 提高数据处理效率。
特征提取和分类识
别
通过机器学习方法，对FERT数据 进行特征提取和分类识别，辅助 研究人员对实验结果进行解读和 分析。
预测模型构建
荧光探针
设计具有特异性识别功能 的荧光探针，用于检测生 物体内的特定分子或离子。
荧光成像技术
结合显微镜、荧光共聚焦 等技术，对生物样品进行 高分辨率、高灵敏度的荧 光成像。
药物筛选与设计
药物靶标研究
01
利用FERT技术，研究药物与靶标蛋白之间的相互作用，为药物
设计提供理论依据。
药物代谢动力学研究
02
在本次项目中，我们将FERT技术应用于多种生物分子相互作用的研究，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA等，进一步 验证了该技术的通用性和可靠性。
建立了完善的实验流程和数据分析方法
通过不断摸索和实践，我们建立了一套完善的FERT实验流程和数据分析方法，为后续的研究提供了重要 的参考和借鉴。
展望未来发展趋势和挑战
开发新型荧光染料和荧光蛋白，提高荧光信号的强度和稳定性， 以增加检测的灵敏度和特异性。
优化实验条件
通过调整实验条件，如温度、pH值、离子强度等，改善荧光共振 能量转移的效率，提高检测效果。
引入信号放大技术
结合信号放大技术，如酶联反应、纳米材料等，增强荧光信号，提 高检测灵敏度。
多模态成像技术在FERT中应用前景
活体成像的应用前景
FERT技术具有非侵入性、高灵敏度等优点，未来有望在活 体成像领域发挥重要作用。然而，活体成像需要解决荧光 染料的生物相容性、光稳定性等问题，这也是未来FERT技 术发展的重要方向之一。
荧光共振能量转移
1990年代
荧光共振能量转移技术开始应用于生物成像 领域。
1970年代
荧光共振能量转移技术开始应用于生物分子 相互作用的研究。
2000年代至今
随着技术的发展和仪器的改进，荧光共振能 量转移技术不断得到优化和应用拓展。
02
荧光共振能量转移
的实验技术
实验设备与试剂
荧光光谱仪
THANKS
感谢您的观看
激发态与荧光态
激发态
分子吸收光子后进入的较高能级状态。
荧光态
激发态分子通过辐射衰变回到基态，释放出光子，即荧光。
能量转移与荧光寿命
能量转移
当一个荧光分子的发射光谱与另一个分子的吸收光谱重叠时，后者可能从前者接收能量， 实现能量转移。
荧光寿命
荧光态分子的平均寿命，即荧光辐射衰变至基态的平均时间。
04
影响因素分析
分析实验结果，探讨荧光共振 能量转移的影响因素，如染料 浓度、溶剂性质、温度等。
应用前景
根据实验结果，探讨荧光共振 能量转移在生物医学、化学、
物理等领域的应用前景。
03
荧光共振能量转移
的理论基础
能级与光谱
能级
分子在吸收特定能量后，电子从基态 跃迁至激发态，形成不同的能级。
光谱
不同能级间存在能量差，当光子能量 与能级差相匹配时，分子吸收光子并 跃迁至激发态。
太阳能电池的光电转换效率和稳定性。
光电器件与太阳能电池的优化
03
通过荧光共振能量转移技术可以对光电器件和太阳能电池进行
优化，提高其性能和应用范围。
05
荧光共振能量转移
的挑战与展望
荧光共振能量转移的局限性
1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个
1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个1.荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。
这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。
优点1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,3.准确度高，操作简便4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,缺点首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。
这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术原理以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
荧光共振能量转移FERT
4. Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997–15002
5. Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599–611
2. Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395
3. Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633
S1 hn0
S0
hn1
T1
hn2
荧光共振能量转移(FRET)现象
1. 供体(Donor, D) 2. 受体(Acceptor, A) 3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
新型光学成像技术——荧光共振能量转移
新型光学成像技术——荧光共振能量转移随着科技的飞速发展，光学成像技术在生物医学和生命科学研究领域中扮演着越来越重要的角色。
而其中的一种新型光学成像技术——荧光共振能量转移技术（FRET），更是在生命科学领域中大放异彩。
那么，什么是荧光共振能量转移技术呢？它能够给生命科学研究带来哪些革命性的进展呢？一、荧光共振能量转移技术的基本原理荧光共振能量转移技术是一种可以测量蛋白质间相互作用的方法。
在这种方法中，两个标记的分子——给体和受体，被分别连接到其中两个要研究的蛋白质上。
给体和受体的色谱特性被设计成相互兼容和相互作用。
当两个标记的分子距离足够近时，给体的荧光发射将与受体的吸收重叠，这时就会产生荧光共振能量转移。
二、荧光共振能量转移技术的应用荧光共振能量转移技术在生命科学领域中有着广泛的应用。
它可以用来研究蛋白质间的相互作用以及分子的信号传递、细胞周期调节和病毒感染等生物学过程。
1、蛋白质间的相互作用研究荧光共振能量转移技术可以用来研究蛋白质之间的相互作用，为研究这些蛋白质的功能提供有力的工具。
在这种技术中，可以使用荧光蛋白来标记蛋白质，这样就可以跟踪蛋白质在细胞内的行动。
利用荧光共振能量转移技术可以测量蛋白质之间的距离，进而了解它们之间的相互作用模式。
2、分子信号传递荧光共振能量转移技术还可以用来研究分子的信号传递过程。
这种技术可以帮助科学家们在细胞中跟踪分子的运动，以及分子之间的相互作用。
这对于了解分子如何激活和控制不同的生物学过程是非常重要的。
3、病毒感染荧光共振能量转移技术在病毒感染方面也有很大的应用潜力。
研究人员可以使用荧光共振能量转移技术来研究病毒如何进入细胞并感染细胞。
这样可以为寻找新型抗病毒药物提供基础。
三、荧光共振能量转移技术的发展前景荧光共振能量转移技术在生物医学研究和生命科学领域中的应用前景广阔。
随着科技的不断发展，荧光共振能量转移技术的精度和效率将不断提高，可以更加准确地测量蛋白质间的距离和相互作用。
fitc 荧光共振能量转移
fitc 荧光共振能量转移
FITC（Fluorescein Isothiocyanate）荧光共振能量转移是一种用于生物分子相互作用研究的技术。
FITC 是一种荧光染料，常用于标记生物分子，如蛋白质、抗体等。
荧光共振能量转移的基本原理是：当一个荧光分子（供体）处于激发态时，如果它与另一个分子（受体）非常接近（通常在 1-10 纳米范围内），激发态的能量可以通过非辐射跃迁的方式转移给受体分子。
受体分子接受能量后，会被激发并发出荧光，而供体分子的荧光强度则会减弱。
在 FITC 荧光共振能量转移中，通常将 FITC 标记的分子（如抗体）作为供体，将另一个荧光分子（如罗丹明）标记的分子作为受体。
当供体和受体分子结合在一起时，激发态的 FITC 可以将能量转移给受体分子，从而使受体分子发出荧光。
通过检测供体和受体分子的荧光强度变化，可以推断出供体和受体分子之间的距离和相互作用。
FITC 荧光共振能量转移技术常用于研究蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用以及其他生物分子之间的相互作用。
需要注意的是，FITC 荧光共振能量转移技术的准确性和可靠性取决于多种因素，如标记分子的性质、实验条件的控制等。
在使用该技术进行研究时，需要进行适当的实验设计和数据分析，以确保结果的准确性和可靠性。
1。
荧光共振能量转移 相互作用 酶标仪
荧光共振能量转移 (FRET) 相互作用是一种重要的生物化学现象，它在许多生物学研究领域中都有着重要的应用。
而酶标仪是一种常用的实验仪器，用于检测和测量各种生物分子的浓度和活性。
本文将从荧光共振能量转移的基本原理、在生物学研究中的应用、以及酶标仪的工作原理和应用等方面进行介绍。
一、荧光共振能量转移的基本原理1. 荧光共振能量转移是指一个荧光分子的激发态能量通过非辐射能量转移的过程，被另一个非激发态的荧光分子吸收的现象。
在此过程中，有一个荧光分子的激发态能量转移到另一个荧光分子，从而导致后者产生荧光。
这种荧光共振能量转移的现象通常用于研究蛋白质、核酸和其他生物大分子的构象变化、相互作用、以及测定它们之间的距离等。
二、荧光共振能量转移在生物学研究中的应用2. 荧光共振能量转移在生物学研究中有着广泛的应用，例如用于研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与小分子的相互作用，以及在细胞内的功能和信号传导等方面的研究中。
荧光共振能量转移技术的发展，促进了生物学研究对分子相互作用、细胞信号传导以及疾病机制等方面的深入了解。
三、酶标仪的工作原理和应用3. 酶标仪是一种用于检测生物分子浓度和活性的仪器，它基于酶标记技术，利用酶和底物之间的特异性反应来测定样品中生物分子的浓度。
酶标仪通过光电检测技术，将样品中的荧光、吸光度等信号转换成可视化的数据，从而实现对生物分子的定量分析。
四、荧光共振能量转移与酶标仪的结合应用4. 荧光共振能量转移技术与酶标仪的结合应用，拓展了酶标记技术在生物学研究中的应用范围。
利用荧光共振能量转移技术可以实现对生物分子的高灵敏度、高通量的检测分析，结合酶标仪的定量测量功能，可以实现对生物分子浓度和活性的精准测定，极大地促进了生物学研究的深入发展。
五、结语在生物学研究领域中，荧光共振能量转移技术和酶标仪的结合应用，为科研工作者提供了强大的工具，促进了对生物分子相互作用、疾病机制和细胞信号传导等方面的深入研究。
荧光共振能量转移法
荧光共振能量转移法荧光共振能量转移法（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种基于分子间能量传递的技术，广泛应用于生物医学领域的研究中。
这一方法通过荧光标记的分子间能量传递的观察，可以研究分子间的相互作用和结构变化。
FRET技术的原理是基于非辐射能量转移的过程。
在FRET中，通常将一个荧光受体标记在感兴趣的分子上，当该受体被激发时，会释放出能量。
而当另一个荧光受体在一定的距离内存在时，能量会通过FRET传递到该受体上，引起其发射荧光。
通过测量受体的荧光发射情况，可以推测出分子间的相互作用情况。
荧光共振能量转移法具有许多优势。
首先，该技术无需直接观察分子的结构，只需通过观察荧光的变化即可推测分子间的相互作用。
因此，FRET可以应用于生物体内或细胞内的实时观察，不依赖于分子的纯化和结晶。
其次，FRET可以在分子尺度上进行测量，能够提供高分辨率的实验结果。
此外，FRET技术可以与其他技术相结合，如光学显微镜、蛋白质工程等，进一步扩展其应用范围。
FRET技术在生物医学领域有广泛的应用。
例如，在蛋白质相互作用研究中，FRET可以用于检测蛋白质的相互结合情况，并研究其空间构型和活性变化。
此外，FRET还可以用于研究细胞内的信号传导过程、蛋白质折叠和解折叠等生物过程。
在药物筛选方面，FRET技术可以用于开发新型药物的高通量筛选，快速评估药物的效果和副作用。
尽管荧光共振能量转移法在生物医学领域存在一些局限性，如需要精确控制荧光标记的位置和数量等，但其仍然是一项非常有潜力的技术。
随着技术的不断发展和改进，FRET将在生物医学研究中发挥更大的作用，为我们解开生命奥秘提供更多的线索。
荧光共振能量转移技术在光催化研究中的应用
荧光共振能量转移技术在光催化研究中的应用光催化是指利用光能使催化反应发生的方法，它是一种绿色环保的催化技术，可以应用于环境治理、能源转化、有机合成等领域。
近年来，荧光共振能量转移技术在光催化研究中的应用越来越广泛，尤其是在有机光催化反应和光催化材料的研究中具有重要的作用。
一、荧光共振能量转移技术的原理荧光共振能量转移技术是一种非辐射能量转移现象，主要利用荧光分子间的相互作用。
当存在两个具有不同波长的荧光分子时，若它们之间的距离在几纳米范围内，那么较短波长的荧光分子就会发生电子激发跃迁，将能量转移给较长波长的荧光分子，使其发射荧光。
这个过程称为荧光共振能量转移。
二、荧光共振能量转移技术在有机光催化反应中的应用有机光催化反应是指通过光敏剂的光激发产生的激发态能量，促进有机反应发生的一种新型化学反应。
传统的有机催化反应需要使用高温高压条件，而有机光催化反应具有反应速度快、选择性高等优点。
荧光共振能量转移技术作为一种非辐射能量转移现象，可以在有机光催化反应中起到扩大吸收光谱和提高光催化反应效率的作用。
例如，利用荧光共振能量转移技术，将荧光分子修饰到光敏剂上，可以有效地提高光敏剂的光吸收能力，增强光催化反应的效率。
同时，荧光共振能量转移技术还可以用于反应中间体的检测和分析，为光催化反应的研究提供了更加优秀的工具。
三、荧光共振能量转移技术在光催化材料研究中的应用光催化材料是指将光催化材料与光催化反应剂相结合，并对其进行表面修饰，以提高光催化效率、选择性和稳定性的材料。
荧光共振能量转移技术可以将荧光分子修饰到光催化材料表面或内部，来研究光催化材料的吸收、转移和发射过程，提高光催化效率和稳定性，并对材料进行监测和表征。
此外，荧光共振能量转移技术还可以用于研究光催化材料和晶体的结构和性质，为材料设计和优化提供重要的参考和指导。
四、总结和展望荧光共振能量转移技术作为一种非辐射能量转移现象，在光催化研究中具有广泛的应用。
FRET荧光共振能量转移
FRET荧光共振能量转移本词条由“科普中国”科学百科词条编写与应用工作项目审核。
当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。
供体和受体之间FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。
中文名•荧光共振能量转移外文名•Förster resonance energy transfer, fluorescence resonance energy transfer(FRET)条件•激发光谱相重叠时简介•供体荧光分子自身的荧光强度衰减范围•两个不同的荧光基团中发生原理荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基发生条件能量供给体－接受体（D–A）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。
此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。
可见，要找到一个合荧光共振能量转移适的D–A对是很不容易的。
tamra 荧光共振能量转移
Tamra 荧光共振能量转移一、概述荧光共振能量转移（FRET）是一种分子之间能量转移的过程，通过这种过程，一个激发态分子的能量可以传递给另一个分子，从而激发另一个分子成为激发态。
这种过程在生物学、生物化学和生物医学等领域中有着重要的应用和意义。
二、原理在FRET中，通常存在一个受体分子和一个给体分子。
当给体分子受到激发而处于激发态时，它会发出一个能量恰好与受体分子的激发态能量相匹配的光子。
这时，受体分子会吸收这个光子，使得受体分子也处于激发态。
在一些情况下，受体分子会通过发出荧光或者其他方式释放掉这部分能量。
三、应用1. 生物标记FRET被广泛应用于生物标记技术中，通过激发和检测受体分子和给体分子之间的能量转移来实现生物分子的定位和监测。
利用荧光共振能量转移技术可以观察蛋白质在细胞内的相互作用，研究生物膜上的受体、通道、酶等分子，并且还可以用作高通量筛选技术。
2. 光学成像FRET也被应用于光学成像领域，通过观察分子间的荧光共振能量转移过程，可以实现高分辨率的光学成像，例如在研究细胞内分子的定位和互作关系方面有着重要的应用。
3. 荧光传感FRET在分析化学和生物医学领域中也有重要应用，例如可以将FRET 技术应用于生物分子或者环境中的化学物质的传感与检测。
四、发展随着生物技术和光学成像技术的不断发展，FRET技术也在不断改进和应用扩展。
更加灵敏和可视化的FRET探针正在不断被设计和制备，为生物医学和生命科学研究提供了更好的工具。
FRET技术也与其他技术相结合，如单分子成像技术、光学和电化学技术等，以实现更加全面和深入的生物分子研究。
五、结语荧光共振能量转移作为一种重要的分子间能量转移方式，在生物学、生物化学和生物医学领域中有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和发展，相信FRET技术将在更广泛的领域中发挥更加重要的作用。
六、优势和挑战FRET技术的优势在于其高度的灵敏度和分辨率，能够实现单个分子层面的检测和成像，同时对生物分子的动态过程有着极佳的监测能力。
荧光共振能量转移(FRET)
原理
FRET系统
分子信标
在较低温度下，分子信标与靶标结合呈 S1 状态，发出荧光。 随着温度升高，分子信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即 S2 状态，从而荧光强度减弱。 温度持续增高，将导致分子信标熔链即 S3 状态，荧光基团振能量转移（FRET）
黎景景
• 两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子 吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能 态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作 用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发 生能量共振转移） • FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电 偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体 激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体 可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光）， 也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着 荧光寿命的相应缩短或延长。
荧光共振能量转移
FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。
）以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
荧光共振能量转移(FERT)
荧光共振能量转移技术
fluorescence resonance energy transfer (FRET)
概念
当供体荧光分子（荧光基团）的发射光谱与受 体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的 距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放 射性的能量转移，即FRET现象，使得供Байду номын сангаас的 荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝 灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧 光）。
荧光共振能量转移(FRET)现象
1. 供体(Donor, D) 2. 受体(Acceptor, A) 3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
Donor
Em. 470nm
CFP
YFP Em. 535nm
Ex. 470nm Acceptor
Ex. 440nm
FRET 原理(Principle)
利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略
FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化
Laser
FRET技术应用四：细胞内钙离子浓度的实时测量
(b)
Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887
我们的方向：
荧光共振能量转移在生物医学检测中的应用 ➢ 荧光共振能量转移用于蛋白质分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于核酸分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于糖分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于其他分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于无机盐离子检测
FRET应用
➢分子定位研究 ➢大分子在细胞内的弥散过程和运输过程研究 ➢蛋白质构象改变研究 ➢分子与分子间相互作用研究 ➢分子合成和降解过程研究 ➢酶活性检测方面
生物物理学中的荧光共振能量转移技术
生物物理学中的荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术(FLIM)是一种用于研究生物分子相互作用和分子结构的生物物理学技术。
该技术基于荧光共振能量转移现象，可以实现分子之间的距离测量，从而揭示它们之间的相互作用。
FLIM广泛应用于蛋白质相互作用、分子团聚、酶催化活性等各种研究领域，在生物医学研究和疾病诊断中具有重要的意义。
什么是荧光共振能量转移？荧光共振能量转移是一种非辐射能量转移过程，发生在两种荧光蛋白分子之间的相互作用中。
当荧光蛋白分子A被激发后，它会向周围的分子发射能量。
如果周围存在另一种荧光蛋白分子B，并且两者距离较近（通常是几纳米到十几纳米），则A分子释放的能量可以传递给B分子，激发B分子发出荧光。
这个过程被称为荧光共振能量转移，通常缩写为FRET。
荧光共振能量转移的原理基于两个原则：1、荧光蛋白分子的激发光谱和荧光光谱是固定的，因此可以根据发射光谱来确定颜色和强度；2、同种荧光蛋白分子之间的能量转移效率与它们之间的距离和相对方向密切相关。
这意味着，测量荧光共振能量转移可以帮助我们确定两个荧光蛋白之间的距离和相对方向。
FLIM原理及应用FLIM技术是基于荧光共振能量转移原理而发展起来的生物物理学技术。
它可以用于定量测量蛋白质、核酸以及其他生物分子之间的距离和相对位置关系，从而揭示它们之间的相互作用。
FLIM技术利用荧光信号的寿命（即荧光信号的持续时间）来识别荧光蛋白相互作用的位置和深度。
具体来说，FLIM技术通过测量荧光蛋白分子的荧光信号的寿命来确定分子之间的距离。
寿命较长的荧光信号通常意味着分子之间的距离较远，反之则意味着它们靠得比较近。
FLIM技术在研究蛋白质相互作用、分子团聚、酶催化活性等生物学研究领域中具有广泛应用。
例如，在蛋白质相互作用研究中，FLIM技术可以帮助研究人员确定蛋白质结合的位置和组成，并揭示蛋白质结合的以及解离动力学。
在酶催化活性研究中，FLIM技术可以提供对酶催化作用机制和环境的独特见解。
Fret荧光共振能量转移
Fret荧光共振能量转移对于分⼦⽣物学来讲，⽣物分析⼿段的发展，是阐明机理的必要条件。
在研究分⼦间相互作⽤的道路上，⼈们不断探索，总结出很多⽅法，免疫技术，晶体衍射，核磁共振等。
1948年，荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）理论被⾸次提出，它可以测定1.0-6.0nm距离内分⼦间的相互作⽤。
1967年，这⼀理论得到了实验验证，将1.0-6.0nm的距离称为光学尺。
⼆⼗世纪⼋⼗年代出，通过科学家的不断探索，Fret技术成功运⽤到蛋⽩质结构的研究中。
⾃Fret荧光共振能量技术诞⽣以来，已结合多种先进的技术和⽅法，如电⼦显微镜，X射线衍射等，推动了分⼦⽣物学检测⼿段的发展。
作⽤原理荧光共振能量转移技术，是采⽤物理⽅法去检测分⼦间的相互作⽤的⽅法。
他适⽤于在细胞正常的⽣理条件下，验证已知分⼦间是否存在相互作⽤。
此⽅法的检测原理如下；将我们要检测的蛋⽩（如图X和Y），分别偶联上D和A荧光蛋⽩，D和A是⼀对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor）。
当⽤430nm的紫光去激发X融合蛋⽩时，它能够产⽣490nm的蓝⾊荧光；同样，当我们⽤490nm的蓝光去激发Y融合蛋⽩时，它能够产⽣530nm的黄⾊荧光。
（结合图1）。
当蛋⽩X和Y间没有相互作⽤时（两者的空间距离>10nm），融合蛋⽩X和Y分别产⽣相应的荧光⽽被检测到，如果蛋⽩X和Y间存在相互作⽤（两者的空间距离需<10nm，结合图2），⽤紫光激发融合蛋⽩X其产⽣的蓝光会被融合蛋⽩Y吸收，从⽽产⽣黄⾊荧光，这时，在细胞内将检测不到蓝⾊荧光的存在。
这时因为能量从X融合蛋⽩转移到了Y融合蛋⽩，这就是荧光共振能量转移技术。
技术难点⼀个理想的Fret相互作⽤体系，要求要有⼀对合适的荧光物质，即供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重叠。
且当供体的激发波长时对受体⽆影响，供体和受体的发射光谱要完全分开，否则容易造成光谱⼲涉，⽽使反应体系不稳定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。
）以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。
例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白质b、YFP（yellow fluorescent protein）。
用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。
将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。
黄色荧光蛋白报告载体，如下图：青色荧光蛋白报告载体，如下图：一．质粒的选择及载体构建：订购：1.带有Sal I和Sac II两个酶切位点的小鼠PEDF过表达克隆质粒2.带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质粒3.pECFP．C1质粒4.pEYFP．C1质粒5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I内切酶6.dna合成酶等二． PEDF核青色荧光蛋白（pECFP-C1）表达载体的构建及鉴定小鼠c57PEDF序列blst获得：1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag 61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag 121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctccaacttc 181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct 241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag 301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc 361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga 421 attgtgtttg agaggaaact tcgagtcaaa tccagctttg ttgcccctct ggagaagtcc 481 tatgggacca ggccccggat cctcacgggc aaccctcgag tagaccttca ggagattaac 541 aactgggtgc aggcccagat gaaagggaag attgcccggt ccacgaggga aatgcccagt 601 gccctcagca tccttctcct tggcgtggct tacttcaagg ggcagtgggt aaccaagttt 661 gactcgagaa agacgaccct ccaggatttt catttggacg aggacaggac cgtgagagtc 721 cccatgatgt cagatcctaa ggccatctta cgatacggct tggactctga tctcaactgc 781 aagattgccc agctgccctt gacaggaagt atgagcatca tcttcttcct gcccctgacc 841 gtgacccaga acttgaccat gatagaagag agcctcacct ctgagttcat tcatgacatc 901 gaccgagaac tgaagactat ccaagctgtg ctgactgtcc ccaagctgaa gctgagcttc 961 gaaggcgaac ttaccaagtc tctgcaggac atgaagctac agtcgttgtt tgaatcaccc 1021 gacttcagca agattactgg caaacccgtg aagctcaccc aagtggaaca cagggctgct 1081 ttcgagtgga atgaagaggg ggcaggaagc agccccagcc caggcctcca gcccgtccgc 1141 ctcaccttcc cgctagacta tcaccttaac caacctttcc tctttgttct gagggacacg 1201 gacacggggg ccctcctctt cataggcaga atcctggacc ccagtagtac ttaa分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Sal I和Sac II 两个酶切位点序列。
设计引物序列如下：Primer F：5、GTCGAC-atgcaggccctggtgctact-3、Primer R：5、CCGCGG-ttaagtactactggggtcca-3、其中GTCGAC为酶切位点Sal I，CCGCGG为酶切位点Sac II。
引物中未加入保护碱基。
具体构建质粒pECFP-C1-pedf步骤：1.pedf片段的pcr扩增，提取和纯化2.有文献报道利用一次中间载体topo载体的构建可以相对容易的将pedf构建到pECFP-C1中，不知道这个实验需要不需要做这一步？3.pECFP-C1质粒的扩增、提取和纯化4.pECFP-C1质粒的酶切5.pECFP-C1片段的去磷酸化用去磷酸化试剂盒Cloned AlkalinePhosphatase(CIAP)将pECFP-C1片段切口去磷酸化。
（不知道是不是必须做这一步）6.pECFP-C1酶切片段的纯化(~4．7kb)试剂盒(琼脂糖凝胶DNA／PCR产物小量回收试剂盒——TaKaR A：DV805A)1．2％琼脂糖凝胶回收的DNA量应大于200ng／ul7.pECFP-C1-pedf质粒的连接和转化8.pECFP-C1-pedf质粒的扩增、提取和纯化（菌液pcr）9.pECFP-C1-pedf质粒的鉴定（送公司测序）三．目标蛋白基因序列及引物设计：分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Kpn I和Xba I 两个酶切位点序列。
设计引物序列如下：Primer F：5、ATGGTACC-。
-3、Primer R：5、ATTCTAGA- 。
-3、其中GTCGAC为酶切位点Kpn I，，CCGCGG为酶切位点点Xba I。
引物中5，端加入保护碱基AT。
pEYFP-C1-目标蛋白载体的构建与上述步骤类似。
四．阳性对照质粒pECFP-C1-YFP的构建及鉴定Primer F：5、-GTCGACATGGTGAGCAAG-3、Primer R：5、-CCGCGGTCTAGATCCGGTG-3、其中GTCGAC为Sal I酶切位点，CCGCGG为Sac II酶切位点。
载体具体构建过程与上述过程相同。
五．PEDF和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的FRET研究1.神经细胞（或胶质细胞）的培养2.PEDF蛋白和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的免疫荧光定位：将神经细胞（或胶质细胞）均匀种植在petri皿里，24h后待细胞贴壁。
PBS液洗细胞3次，再用4％多聚甲醛固定15min，PBS液洗3次。
用0.5％Triton穿孔15min，再用PBS洗3次每次5min。
然后用I％BSA封闭30min。
将petri皿小室内液体吸干净，加入用I％BSA按1：1000稀释好的PEDF和目标蛋白抗体，4℃过夜后，用PBS洗3次，加入二抗，37。
C孵育1h。
用PBS洗3次。
此过程注意避光。
加200ulFluo—Anti fading medium防止荧光淬灭，在共聚焦显微镜下观察。
3.荧光融合蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的表达：质粒转染48h后荧光显微镜下观察并拍照后，细胞提取总蛋白进行免疫蛋白印迹分析4.激光共聚焦显微镜检测FRET：利用脂质体法将pECFP-PEDF和pEYFP-目标蛋白共转染原代神经细胞。