第四节核酸的理化性质-变性、复性与杂交
第4讲核酸分子杂交技术
第4讲核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(DNA/DNAorDNA/RNA)核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)主要内容第一节分子杂交技术的理论基础第二节核酸分子杂交的方法第三节核酸杂交的探针第一节分子杂交技术的理论基础核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院(CarnegieIntituteofWahington)的RoyBritten及其同事发明的关键步骤：变性—杂交(复性)--检测信号—结论变性复性DNA-DNA杂交双链分子信号的采集与处理结论一、DNA变性与复性(一)DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA 链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：1)热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。
2)酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。
3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂3、核酸溶液变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程)4、DNA变性曲线AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的变性DNA/总DNATm值：50%DNA分子发生变性的温度(即熔解曲线中点对应的温度),这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度(meltingtemperature,Tm)Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间的关系(G+C)%=(Tm-69.3)某2.44Tm=(G+C)%某0.41+69.3Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH值、离子强度和DNA的碱基比例DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/lNaCl溶液中较稳定(二)复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。
生物化学课件 第四章 核酸杂交
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
核酸理化性质讲义
核算理化性质-讲义目录1.一般物理性质；2.核酸的紫外吸收；3.变性；4.复性；5.杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。
教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性1.一般物理性质1.1形态DNA —— 白色纤维状固体 RNA —— 白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。
RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L NaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定； DNA在碱性溶液中稳定。
显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。
核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。
脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。
1.3粘度DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大)RNA溶液粘度要小得多★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。
效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。
应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
2. 紫外吸收性质2.1机理：嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。
2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。
对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
性质2：纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.02.3.定义：增色效应(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质
食品生物化学
图5-15 RNA紫外吸收曲线
波长nm
食品生物化学
四、核酸的变性与复性
当核酸在某些理化因素（如有机溶剂、酸、碱、尿素、加 热及酰胺等）作用下，互补碱基对间的氢键断裂，双螺旋结构 松散，变成单链的过程称为变性(denaturation)。变性使核酸的 二级结构、三级结构改变，但核苷酸排列顺序不变。变性后的 核酸理化性质改变，生物学活性丧失。
核酸是相对分子质量很大的高分子化合物，高分子溶液比 普通溶液黏度要大得多，高分子形状的不对称性愈大，其黏度 也就愈大，不规则线团分子比球形分子的黏度大，线形分子的 黏度更大。由于DNA分子极为细长，因此即使是极稀的溶液也 有极大的黏度，RNA的黏度要小得多。
二、核酸的酸碱性质
核酸和蛋白质一样，也是两性电解质，在溶液中发生两性 电离。因磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故其等电点偏于酸性。 利用核酸的两性解离能进行电泳，在中性或偏碱性溶液中，核 酸常带有负电荷，在外加电场力作用下，向阳极泳动。利用核 酸这一性质，可将相对分子质量不同的核酸分离。
DNA的变性是可逆的。变性DNA在适当条件下，变性的两 条互补链重新结合，恢复原来的双螺旋结构和性质，这个过程 称为复性(renaturation)。热变性的DNA经缓慢冷却（称退火处 理）即可复性。最适宜的复性温度比Tm值约低25℃，这个温度 又叫退火温度。
食品生物化学
图5-16 两种不同来源的DNA在260nm的吸收值与温度变化的关系
食品生物化学
DNA的解链过程发生于一个很窄的温度区内，DNA的变性 过程是爆发式的，有一个相变过程，把A260达到最高值的一半时 对应的温度称为该DNA的解链温度或融解温度，用Tm表示。 Tm值大小与DNA碱基组成有关，由于G-C之间的氢键联系要比 A-T之间的氢键联系强得多，故G＋C含量高的DNA其Tm值越高。 通过测定Tm值可知其G＋C碱基的含量。
核酸的理化性质
DNA变性的特点－爆发式
变性作用发生于一个很窄温度范围内。
34
Tm值
DNA 的 双 螺 旋 结 构 失 去 一 半 时 对 应 的 温 度 称 为 DNA的解链温度（Tm）。
浓 度 50ug/mL 时 ， 双 链 DNA A260=1.00; 完全变性（单链）时， A260= 1.37 。当 A260 增加到最大 增大值一半时，即 1.185 时，对 应的温度即为Tm 。
8
P503
③按磷酸二酯键断裂方式分类： 3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶 5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
P482
蛇毒磷酸二酯酶从核酸的5’端逐个水解下5’核苷酸 牛脾磷酸二酯酶从核酸的3’端逐个水解下3’核苷酸
9
蛇毒磷酸二酯酶从核酸的5’端逐个水解下5’核苷酸,称为核酸5’ 外切酶，水解3’-OH形成的酯键。 牛脾磷酸二酯酶从核酸的3’端逐个水解下3’核苷酸，称为核酸3’ 外切酶，水解5’-OH形成的酯键。 10
13
14
四、N-糖苷酶类：各种非特异的糖苷酶或对碱基特异
的N-糖苷酶，可水解糖苷键。
15
第二节 核酸的酸碱性质
核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸
也就具备了可解离的酸碱性质。
16
1.碱基的解离
由于嘧啶和嘌呤化合物杂环中N以及各取代基（-OH） 具结合和释放质子的能力，所以这些物质既有碱性解离又 有酸性解离。 各种碱基的解离特点及其常数见课本P505
1、Southern Blotting (DNA-blotting) 2、Northern Blotting (RNA-blotting) 3、Western Blotting (protein-blotting)
核酸的理化性质及杂交
第四节核酸的主要理化性质一、核酸的一般性质⒈酸性化合物⑴两性\但酸性强。
⑵电泳行为--泳向正极（pH7-8）。
⑶沉淀行为--加盐（中和电荷）M+与磷酸"-"中和；乙醇。
⒉高分子性质⑴粘度大，DNA>RNA⑵超离心沉降⑶凝胶过滤二、核酸的UV吸收―――最大吸收峰在260nm附近⒈原因：嘌呤和嘧啶碱基都含有共轭双键⒉应用：定性、定量分析核酸；作为核酸变性和复性的指标⒊计算：课本P24第五节核酸的变性、复性与杂交一、 DNA的变性⒈定义：核酸在某些理化因素（温度、pH、离子强度等）作用下，DNA双链的互补碱基之间的氢键断裂，使双螺旋结构松散成为单链的现象。
⒉分类：根据变性因素区分为碱变性、热变性等。
如DNA的碱变性、DNA的热变性，其中DNA的热变性是实验室最常用的变性方法，它更具典型意义。
⒊变形后表现：粘度改变，钢性线性分子变得无序，粘度下降，UV吸收增强，其规律如下：⑴增色效应定义：（课本P25）述：核酸变性后、氢键破坏，双螺旋结构破坏，碱基暴露，紫外吸收（260nm）增强，又称高色效应。
⑵解链温度\融解温度（Tm）定义：UV吸收增值达到最大吸收增值50%时的温度称Tm。
⑶应用：①Tm与DNA G+C含量有关，G+C含量愈大Tm愈高，反之则反；②与核酸分子长度有关，分子愈长，Tm愈高。
③Tm值的计算公式：（（课本P25）说明：DNA变性时只改变其空间结构，不改变它的核苷酸序列。
二、DNA的复性⒈定义：（课本P25）述：DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。
⒉退火：热变性DNA经缓慢冷却后复性的过程，不发生复性。
⒊减色效应：核酸复性时UV下降，此称低色效应。
说明： DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。
⒋退火温度：DNA变性后，比Tm约低25°的温度三、分子杂交⒈定义：（课本P25－26）述：当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，可形成碱基配对，出现复性现象形成杂种核酸分子，称杂化双链及核酸分子杂交。
核酸的理化性质PPT
由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低 ，整个分子相当于多元酸。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶
液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸
。
2020/4/10
5
三. 紫外吸收性质
嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸 收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯 的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核 酸含量。
核酸的理化性质
2020/4/10
1
一.一般的物理性质
1. 形 态
➢ DNA —— 白色纤维状固体 ➢ RNA —— 白色粉末状固体
2020/4/10
2
一.一般的物理性质
2. 溶 解性
➢ 微溶于水
➢ 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂
➢ RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液
这是由于变性的DNA双螺旋解体，藏于螺旋内 部的碱基暴露出来。
增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。
2020/4/10
9
4. 热变性曲线(熔解曲线)
(一) 变 性
在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。
变性百分率 A260
不 同 DNA 的 熔 解
100
曲线不同，但很
类似。都是 —
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0
2020/4/10
6
(一) 变 性
1. 变性的概念
四.变性与复性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空 间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
A260值升高 粘度下降
核酸的变性及复性
变性DNA的性质（之二）
溶液旋光性发生改变
变性后整个DNA分子的对称性及分 子局部的构型发生改变，使DNA溶 液的旋光性发生变化
变性DNA的性质（之三）
增色效应或高色效应
（ hyperchromic effect ） DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收 作用增强的效应
增色效应（一）
DNA分子在250－280nm 波长具有吸收 紫外光的特性，其吸收峰值在260nm 紫外吸收的结构基础是：DNA分子中碱基 间电子的相互作用 双螺旋结构中，有序堆积的碱基“束缚” 了这种作用 DNA变性后，双链解开，碱基间电子的相 互作用更有利于紫外吸收， 故而产生了增 色效应
Cot曲线
Cot l/2：在标准条件下（一般为0.18mol/L 阳离子浓度，400 核苷酸的片段长度）测得 的复性率达 50% 时的 Cot值 Cot l/2与核苷酸对的复杂性成正比 原核生物核酸分子， Cot l/2可代表基因组 的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度 真核生物基因组中，因含有许多不同程度的 重复序列（repetitive sequence ），因此 Cot曲线要比S曲线复杂
核酸的变性和复性
• DNA的变性 • DNA的复性 • 核酸分子杂交
核酸的变性和复性
变性（denaturation） 复性（renaturation）
双链核酸分子的二个重要物理特性
双链DNA、RNA双链区、DNA:
RNA杂交双链（hybrid duplex） 以及其它异源双链核酸分子 （heteroduplex）都具有此性质
正比
溶液中DNA分子越多，相互碰撞结
合“成核”的机会越大
DNA顺序的复杂性
知识点5核酸的性质
4.5核酸的性质核酸的性质一、解离性质多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。
磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。
DNA等电点4—4.5RNA 等电点2—2.5RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。
二、水解性质1、碱水解室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
在相同条件下，DNA不被水解。
这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。
DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。
DNA稳定，遗传信息。
RNA是DNA的信使，完成任务后降解。
2、酶水解生物体内存在多种核酸水解酶RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外一切酶核酸内切酶最重要的：限制性核酸内切酶三、光吸收性碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。
2、含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）或：20ug/mL核苷酸3、增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
四、沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。
相对沉降常数线型双螺旋分子 1.00松驰双链闭环 1.14切刻双链环 1.14单链环 1.14线型单链 1.30正超或负超螺旋双链环状 1.41坍缩 3.0五、变性、复性及杂交变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。
生物化学 第二版 6核酸的性质
二、核酸的酸碱性
01 02
03 04
三、核酸的紫外吸收
嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键
碱基
紫 外
核苷 ➢ 240nm～290 nm的紫外波段有强烈
线
核苷酸 的吸收峰；
核酸 ➢ 最大吸收值在260 nm附近。
三、核酸的紫外吸收
核酸的紫外吸收：
➢ 碱基紧密堆积在一起，核酸的Fra bibliotek6.核酸的性质
主讲人：
核酸的性质
1、核酸的一般性质 2、核酸的酸碱性 3、核酸的紫外吸收 4、核酸的变性、复性和分子杂交
复习：核酸的结构
DNA的结构
一级结构 二级结构
脱氧核苷酸的 排列顺序
双螺旋结构
三级结构
超螺旋结构
RNA的结构
核苷酸的排列顺序 一条单链通过自身回折 形成双螺旋和环状突起
一、核酸的一般性质
1.物种和个体间亲缘关系研究； 2.疾病诊断研究。
小结
1、了解核酸的一般性质； 2、熟悉核酸的酸碱性； 3、掌握核酸的紫外吸收； 4、掌握核酸的变性、复性 5、比较：核酸与蛋白质的性质
谢谢
➢ 核酸微溶于水，不溶于乙醇； ➢ DNA和RNA的钠盐比游离酸在水中的溶解度大； ➢ DNA和RNA在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同：
0.14mol/L NaCl -
+
1~2mol/L NaCl +
-
乙醇沉淀
一、核酸的一般性质
4、沉降特性
➢ 核酸受到强大离心力的作用时可从溶液中沉降下来； ➢ 沉降速度与核酸的大小和密度有关； ➢ 可用超离心法纯化核酸或将不同构象的核酸进行分离，
紫
紫外吸收值比其各核苷酸成分
核酸的理化性质
核酸的理化性质
１、DNA的变性
在某些理化因素作用下，如加热，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为变性。
监测是否发生变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸光值变化。
解链过程中，吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，称为DNA的增色效应。
紫外光吸收值达到最大值的50％时的温度称为DNA的解链温度（Tm），一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的G＋C比例相关，G＋C比例越高，Tm值越高。
２、DNA的复性和杂交
变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性，其过程为退火，产生减色效应。
不同来源的核酸变性后，合并一起复性，只要这些核苷酸序列可以形成碱基互补配对，就会形成杂化双链，这一过程为杂交。
杂交可发生于DNA －DNA之间，RNA－RNA之间以及RNA－DNA之间。
六、核酸酶（注意与核酶区别）
指所有可以水解核酸的酶，在细胞内催化核酸的降解。
可分为DNA酶和RNA酶；外切酶和内切酶；其中一部分具有严格的序列依赖性，称为限制性内切酶。
生物化学名词解释
1.核酸分子杂交: 不同来源的DNA单链与DNA或RNA链彼此可有互补的碱基顺序，可通过变性、复性以形成局部双链，即所谓杂化双链，这个过程称为核酸的杂交。
2.核酸的变性: 在某些理化因素作用下，核酸分子中的氢键断裂，双螺旋结构松散分开，理化性质改变，失去原有的生物学活性既称为核酸变性。
3.核酸的复性:变性的核酸在适当的条件下，两条互补链课重新恢复为天然的双螺旋构象，称为复性4蛋白质变性:在某些理化因素下，蛋白质的一级结构不变，空间结构破坏，理化性质改变，生物活性丧失。
称为、、、5活性中心:酶分子中结合、催化底物的部分。
6 酶原：细胞内合成或分泌的无活性的酶的前体。
7修饰酶:在其它酶的作用下与某些化学基团发生共价键结合，而改变活性的酶。
（酶的化学修饰：指酶蛋白肽链上的某些基团可在另一种酶的催化下，与某些化学基团发生可逆的共价结合，从而影响酶的活性，又称共价修饰。
最常见磷酸化与脱磷酸化8别构效应剂:一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分非共价键可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性。
这些代谢物称为别构效应剂。
9 限速酶别构酶与修饰酶通常调节一些单向或慢速反应，其活性改变可以调节总反应速度，又称为限速酶。
10竞争性抑制：抑制剂与底物的化学结构似，竞争酶的活性中心，抑制酶的活性。
11非竞争性抑制：抑制剂与底物结构不相似，不竞争酶的活性中心，而是与活性中心外的必需基团结合，抑制酶的活性。
12蛋白质的结构域:蛋白质三级结构被分割成一个或数个球状或纤维状折叠较为紧密的区域，各行其功能，该区域称为结构域。
13、糖异生: 由非糖物质乳酸、甘油、氨基酸等转变为葡萄糖或糖原的过程称为糖异生。
14、必需脂肪酸: 维持机体生命活动所必需，但体内不能合成，必须由食物提供的脂肪酸，称为必需脂肪酸。
15、限制性内切核酸酶: 是指能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
16、冈崎片段: DNA复制时，随从链复制中的不连续片段，称为、、17、联合脱氨基作用：转氨酶与L-谷氨酸脱氢酶或腺苷酸脱氨酶联合作用脱去氨基酸的氨基，此称联合脱氨基作用。
核酸的物理化学性质和常用的研究方法
25
七、聚合酶链反应（PCR）
2、优化反应条件 包括模板、引物、 dNTP、DNA聚 合酶和Mg2＋，PCR中常用的聚合酶是 Taq DNA聚合酶 3、 选择热循环温度 PCR 过程的温度控制十分关键。 热循环温度：变性温度，退火温度（低 于引物Tm值的2-3℃），延伸温度
A：光吸收值 C：磷的摩尔浓度 L：比色杯内径 W：每升溶液中磷的重量（g）
4
一、核酸的紫外吸收
DNA的ε(P)：6600 RNA的ε(P)：7700-7800
核酸的ε(P)比核苷酸单体低 单链多核苷酸的ε(P)比双螺 旋多核苷酸的ε(P)要高 增色效应：核酸变性时， ε(P)增加 减色效应：当核酸复性时， ε(P)降低
第十九章
核酸的物理化学性质 和常用的研究方法
1
核酸的物理化学性质
天然DNA分子细丝状的双螺旋结构 赋予DNA一系列显著的物化特性： 极大的粘度； 易于断裂； 易形成纤维状物质； 在稀盐溶液中热变性； 熔点高 RNA分子没有如此明显的物化特性
2
一、核酸的紫外吸收
1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm λmax = 260nm （定量测定） 2、根据紫外吸收判断样品纯度 不纯的样品
29
九、DNA的限制酶图谱
细菌内有二种不同功能的酶(Arber等) ： 限制性内切酶：识别并水解DNA的某特 定碱基序列 修饰酶(甲基化酶)：识别限制酶识别的碱 基顺序并将其甲基化 被甲基化了的DNA不会被限制酶降解， 所以细菌自身的DNA不会被自身酶降解。 而当异源DNA侵入细胞时，就会被限制酶 降解
核酸的重要理化性质
2.DNA变性后的表现
A260值增加 粘度下降 浮力密度增大 分子量不变
3.DNA的热变性和解链温度（Tm）
用加热的方法使DNA变性叫做热变性 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区 间内完成。因此，通常将DNA的变性达到50%时， 即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温 度（melting temperature,Tm）,Tm也称熔解温 度或DNA的熔点。
A260
0.02
0.1
1.0
mol/LKCl
温度/0C
DNA变性（加热或极端pH）
当DNA的稀盐溶 液加热到80100℃时，双螺 旋结构即发生解 体，两条链彼此 分开，形成无规 线团。 DNA变性后，它 的一系列性质也 随之发生变化， 如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘 度降低等。
4、核酸的复性
0.14mol/LNaCl 1-2mol/LNaCl + + -
DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或 降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速 度与核酸的大小和密度有关。
二、核酸的两性性质及等电点
与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基） 也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈 现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内 的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电 荷相等时，此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI） 如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。核酸 在其等电点时溶解度最小。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种 作用。
核酸性质
核酸的凝胶电泳
核酸的序列测定 DNA聚合酶链反应 DNA的化学合成
第十五章 核酸的研究方法
一 核酸的分离、提纯和定量测定
核酸制备
总的要求：防止核酸的降解和变性，要尽量保
持其在生物体内天然状态
注意的事项：条件温和，防止过酸、过碱、避
免剧烈搅拌，防止核酸酶作用
P513
第十五章 核酸的研究方法
（一）DNA的分离
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交
2. 常见杂交的类型
（1）Southern blotting （2）Northern blotting （3）Western blotting
（1）. Southern印迹杂交
将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂 交作用检测这些被转移的DNA片段
经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44
(3)介质中的离子强度 一般在较高的离子强 度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在 一个较小的温度范围之内。
P509
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（二）、复性 (renaturation)
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺 旋结构，这过程称复性 1. DNA复性的特点：
一、 核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及分子杂交 五、核酸的沉降特性
502
Chapter14
核酸的物理化学性质
核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法辅导版
为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲 酸（98%～100%）密封加热至175℃2h，无论RNA 或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺 点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加 热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的 回收率显著提高。
DNA分子的热变性曲线
异质的
DNA变性温
度范围宽，
均质的DNA 变性温度范
bacterial DNA
Viral DNA
围窄。
影响DNA分子Tm的因素
（1）G－C含量：G－C之间有3个氢键，所以G －C含量越高Tm越高。通过测定Tm值，可以推
算出DNA中G－C的含量，其经验公式为:
xGC (Tm 69.3) 2.44
RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变
性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲
酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与 双链DNA相同。
1.一种浮萍的18SrRNA
2.酵母的杀伤RNA（双 链）加甲酰胺
3.同2，但无甲酰胺
DNA的复性
变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的
单 链重 新 缔合 成 双链 DNA， 这 个 过程 称 为复 性 （renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却， DNA不 能 复性 ， 只有 缓 慢降 温 才能 使 热变 性 的 DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第四节核酸的理化性质
一、酸性化合物
两性\但酸性强。
电泳行为--泳向正极（pH7-8）。
沉淀行为--加盐（中和电荷）M+与磷酸"-"中和；乙醇。
二、高分子性质
粘度DNA>RNA
超离心沉降
凝胶过滤
三、UV吸收最大吸收峰在260nm附近
四、变性、复性与杂交
核酸在理、化因素作用下，双螺旋结构破坏称核酸变性。
根据变性因素区分为碱变性、热变性等。
如DNA的碱变性、DNA的热变性，其中以DNA的热变性更具典型意义。
DNA变性后，粘度改变，钢性线性分子变得无序，粘度下降，UV吸收增强，其规律如下：高色效应--核酸变性后、氢键破坏，双螺旋结构破坏，碱基暴露，紫外吸收（260nm）增强，谓高色效应。
解链温度\融解温度（Tm）--UV吸收增值达到最大吸收增值50%时的温度，称Tm。
Tm值与DNA G+C含量有关，G+C含量愈大，Tm愈高，反之则反；与核酸分子长度有关，分子愈长，Tm愈高。
变性温度范围与DNA样品均一性有关，分子种类愈纯（单一），长度愈一致，其变性范围愈窄，反之则变性温度范围愈宽。
DNA变性的复性—DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。
核酸复性时UV下降，此称低色效应。
DNA热变性后缓慢冷却处理过程称退火。
DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。
核酸分子杂交—当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。