蛋白质药物聚乙二醇修饰技术
peg修饰的原理
peg修饰的原理
PEG修饰的原理
PEG修饰，指在蛋白质上加入聚乙二醇分子，是一种常见的蛋白质修饰方式。
其原理主要涉及到PEG分子的化学性质和与蛋白质的相互作用。
1. PEG分子的化学性质
PEG分子是由乙二醇单元重复组成的聚合物。
它具有许多独特的化学性质，如高水溶性、低毒性、抗生物降解性等。
在药物研发领域中，PEG分子被广泛应用于蛋白质修饰，通过改变蛋白质的物理化学性质，提高药物的稳定性和生物利用度。
2. PEG与蛋白质的相互作用
PEG分子可以通过两种方式与蛋白质相互作用，即共价修饰和非共价修饰。
其中，非共价修饰方式是目前使用最广泛的一种方式。
非共价修饰方式是通过PEG分子与蛋白质的电荷、亲疏水性等物理化学性质的相互作用来实现。
具体来说，PEG分子中的羟基与蛋白质表面的氨基酸残基或酸残基形成氢键或疏水作用。
这种相互作用形成的PEG修饰物可以有效地抑制蛋白质的凝聚、聚集和降解，提高其稳定性和口服生物利用度。
3. PEG修饰的优势
PEG修饰具有许多其他修饰方式无法替代的优势。
首先，PEG修饰可以改变蛋白质表面的电荷状态，从而影响蛋白质与细胞膜的相互作用，提高蛋白质的生物利用度和药效。
其次，PEG修饰可以延长蛋白质在体内的半衰期，减少药物注射次数，降低毒性和副作用。
最后，PEG修饰可以提高蛋白质的稳定性，降低其在制造、运输和储存过程中的损失。
总之，PEG修饰是一种十分有效的蛋白质修饰方式，可以提高药物的生物利用度、稳定性和安全性。
在药物研发领域中，PEG修饰已成为一种常见的技术手段，广泛应用于新药研究和临床治疗中。
聚乙二醇修饰小分子药物的修饰位点（氨基羧基疏基二硫键糖基）
聚乙二醇修饰小分子药物的修饰位点（氨基羧基疏基二硫键糖基）鉴于PEG修饰对药物性质产生的巨大影响，PEG修饰成为药物研发以及已上市药物药效改善的重要途径。
那么，如何进行PEG修饰则成为重中之重。
首先，需要选择合适的PEG来进行分子修饰。
对修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：(1)PEG相对分子质量（Mr）的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。
应用过大的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性。
而使用低Mr (<20000)的PEG修饰蛋白药物，修饰后的蛋白药物较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质改变，所以，一般选择在40000- 60000范围内的PEG作为修饰。
(2)修饰位点的选择要根据蛋白质构效关系分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。
常用的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和巯基修饰；(3)PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性依赖于修饰剂的化学性质与修饰位点的选择。
目前常见修饰剂见表1；(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应的条件控制，特别是pH的控制。
一般来说，PEG修饰剂的反应活性高，则其稳定性就差，容易水解；(5)PEG修饰后的蛋白活性、毒性和抗原性与PEG的大小和修饰类型有关。
一般随着PEG 的Mr的增大，蛋白的活性损失也逐渐增加，另外不同的PEG修饰剂对蛋白的生物活性影响不同。
最后，选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行定点修饰。
用活化后的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行定点修饰，从而改善天然蛋白质的疗效。
蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一，给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。
根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科研人员在用PEG进行修饰时，根据蛋白质的构效关系进行分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白药物除具有PEG修饰所带来的优良性质外依然具有较高的生物活性。
蛋白质药物PEG化学修饰指南
蛋白质药物PEG化学修饰指南蛋白质是生物体内重要的功能分子，具有广泛的生物学活性和药理学特性。
然而，许多蛋白质药物在药理特性和药代动力学方面存在一些局限性，例如短半衰期、不稳定性和免疫原性。
为了克服这些问题，PEG（聚乙二醇）化学修饰被广泛应用于蛋白质药物的研究和开发中。
PEG化学修饰可以通过共价结合PEG与蛋白质分子来改善药物的性能，如增加药物在体内的半衰期、提高稳定性和降低免疫原性。
在PEG化学修饰指南中，主要涉及以下几个方面：1.PEG化学修饰的方法：- PEGylation是指将PEG与蛋白质以共价键合的方式连接，一般是通过反应PEG基团与蛋白质表面的氨基酸残基（如Cys、Lys等）进行连接。
- PEG化学修饰的方法有很多种，包括活性酯化、磺酸化、碳酰二亚甲基化等。
不同的化学修饰方法可以实现不同的PEGylation效果。
2.PEG化学修饰的影响因素：-PEG的分子量和结构对修饰效果有显著影响。
PEG的分子量可以影响药物的溶质性、药物在体内的清除速度等。
此外，PEG的结构也会影响修饰的效果，例如PEG的链长、支链结构等。
-蛋白质的性质也会影响PEG化学修饰的效果。
蛋白质的结构、表面氨基酸残基的分布和可修饰性等都会对修饰效果产生影响。
3.评价PEG化学修饰的方法：-对PEG化学修饰效果的评价可以从多个方面进行，包括药物的稳定性、溶质性、免疫原性和药效等。
-其中，评价药物的稳定性可通过测定药物在不同环境条件下的稳定性来进行；溶质性的评价可通过测定药物的水溶性和溶解度来进行；免疫原性的评价可以通过动物实验和免疫学方法进行；药效的评价则需要进行体内体外的药效研究。
4.PEG化学修饰的应用：-PEG化学修饰可以用于改善蛋白质药物的稳定性，提高药物在体内的半衰期，并降低免疫原性。
这使得药物能够更好地在体内发挥药理学作用。
-由于PEG的降解机制复杂，PEG化学修饰也可以用于控制药物的释放速率和疗效。
这对于长期治疗和控制药物血浆浓度非常重要。
蛋白质的PEG化学修饰
bin at Cys293(beta):correlation be-
tween the colligative properties of the
PEGylated protein and the length of
蛋白质上的修饰基团多为亲核性的, 其 活 性 的 顺 序 是 :巯 基 >α -氨 基 >ε -氨 基>羟 基 。所 以 可 以 选 取 能 够 特 异 性 PEG修 饰 剂 对 数 目 稀 少 巯 基 进 行 定 向 修 饰 。此 类 PEG修 饰 剂 主 要 有 :
图 １ 三聚氯氰 － Ｐ Ｅ Ｇ 对蛋白质氨基的修饰
由于高锰酸钾过量时,处理后的水会 显 粉 红 色 。因 此 ,我 们 随 时 观 察 滤 前 水 的 变 化,要求值班人员每半个小时取滤前水水 样进行过滤,观察其颜色。
我们曾经考虑在水库出水口投加高锰 酸钾,这样,就可以把进厂水中的溶解性锰 含 量 控 制 在 0.1mg/L以下,但 由 于 我 们 的 输配水管在途中有农民灌溉用,所以,也只 能把投加点放在配水井。
中锰去除而保证水质(见表3)。
酸钾。
５ 投加高锰酸钾需要注意的问题
若高锰酸钾投加量超过需要量,处理 后的水会显粉红色,这是需要避免的,所以 必 须 严 格 控 制 。高 锰 酸 钾 投 加 量 允 许 在 一 定的安全幅度内变动,在安全幅度内,处理 水 的 性 状 可 保 持 良 好 。此 安 全 幅 度 的 大 小 随 水 中 PH值 而 变 ,PH值 越 高 ,幅 度 越 宽 ,且 所需投加量也相对减小。
蛋白质药物PEG修饰技术
蛋白质药物PEG修饰技术蛋白质PEG修饰技术概述聚乙二醇具有较广的分子量分布，随着平均分子量的不同，性质也产生差异，当分子量小于1000Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是蜡状白色固体，固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。
毒性随分子量的增加而减少，小于400Da的 PEG在体内会经乙醇脱氢酶降解成有毒的代谢物，而分子量大于1000 Da的PEG经过多年应用于食品业、化妆品业和制药业证明没有毒性。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，因而具有良好的水溶性，同时又可溶于除乙醚、己烷、乙二醇以外的大部分有机溶剂。
大多数蛋白质经聚乙二醇修饰后，除保留或增加其水溶性外，还可以获得在一些有机溶剂中的溶解性。
在蛋白质溶液中，聚乙二醇无论是处于游离还是结合形式，即使浓度很高，对蛋白质分子都没有副作用。
聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。
聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106Da，本身的免疫原性也很低。
临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚乙二醇抗体产生。
在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。
常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。
这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>氨基>氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。
根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。
巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很难活化。
因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基。
peg修饰蛋白质方法
peg修饰蛋白质方法PEG修饰蛋白质方法引言：蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，它们在细胞内扮演着各种重要角色。
为了研究蛋白质的功能和相互作用，科学家们开发了各种方法来修饰蛋白质。
其中，聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）修饰蛋白质的方法被广泛应用于生物医学领域。
本文将介绍PEG修饰蛋白质的方法及其应用。
一、PEG修饰蛋白质的方法1. PEG基团的引入PEG修饰蛋白质的关键是将PEG基团引入蛋白质分子中。
目前常用的方法有两种：一种是通过化学反应将PEG基团与蛋白质共价结合，另一种是通过基因工程技术将编码PEG基团的DNA序列导入到蛋白质的基因中。
2. 化学修饰方法化学修饰方法是将PEG基团与蛋白质中的氨基酸残基或硫醇基团发生反应，形成共价键。
常用的化学修饰方法包括：PEG酰胺化反应、PEG醚化反应和PEG硫醇化反应等。
这些化学反应通常在适当的pH和温度条件下进行，以确保修饰反应的效率和选择性。
3. 基因工程方法基因工程方法是将编码PEG基团的DNA序列导入到蛋白质的基因中，通过细胞内的转录和翻译过程，使蛋白质合成时含有PEG基团。
这种方法可以通过改变基因序列来调控PEG基团的大小和数量，从而实现对修饰蛋白质性质的调控。
二、PEG修饰蛋白质的应用1. 增加蛋白质的稳定性PEG修饰可以增加蛋白质的稳定性，延长其在体内的半衰期。
由于PEG具有较大的分子量和极性，可以形成保护层，防止蛋白质受到蛋白酶的降解或免疫系统的清除。
这使得修饰后的蛋白质在体内停留的时间更长，从而增加了治疗效果。
2. 改善蛋白质的溶解性某些蛋白质在溶液中很难溶解或易于聚集形成沉淀。
PEG修饰可以改变蛋白质的溶解性，使其在溶液中更加稳定。
这对于蛋白质的储存、运输和应用具有重要意义。
3. 调控蛋白质的功能PEG修饰可以改变蛋白质的生物活性和相互作用。
例如，PEG修饰可以调节蛋白质的酶活性、受体结合亲和力和信号转导等功能。
peg修饰蛋白 实验步骤
peg修饰蛋白实验步骤
修饰蛋白是指通过化学或生物方法改变蛋白质的结构或功能。
PEG（聚乙二醇）是一种常用的修饰剂，可以用于增加蛋白质的稳定性、溶解性和可溶规模等。
以下是用PEG修饰蛋白的实验步骤的一般流程：
1. 准备实验材料和试剂：包括蛋白质、PEG修饰试剂、缓冲液、还原剂、凝胶电泳等。
2. 确定实验方案：确定蛋白质的修饰条件，包括PEG修饰剂的浓度、反应时间和温度等。
3. 准备修饰反应体系：将蛋白质加入合适的缓冲液中，并加入适量的PEG修饰试剂。
4. 进行PEG修饰反应：将蛋白质和PEG修饰试剂混合，使其在适当的反应条件下进行修饰反应。
5. 控制修饰反应的时间和温度：根据所需的修饰程度，控制修饰反应的时间和温度，一般在室温下进行。
6. 终止修饰反应：通过添加适当的试剂终止修饰反应，如还原剂。
7. 分离和纯化修饰蛋白：可使用凝胶电泳、柱层析、过滤等方法将修饰后的蛋白质分离和纯化。
注意事项：
- 实验过程中需注意实验条件的控制，如温度、pH值等。
- 选择合适的PEG修饰试剂，根据具体实验需求进行选择。
- 在实验设计中考虑到后续操作，如修饰后的蛋白质使用于何种实验或应用。
这只是一个大致的实验流程，具体步骤可能会因实验目的、蛋白质特性等有所变化。
因此，在进行实验之前，最好参考相关文献并根据实验需求进行具体的实验设计和优化。
PEG修饰蛋白药物关键质控方法研究
PEG修饰蛋白药物关键质控方法研究PEG修饰蛋白药物是一种常见的药物改良技术，它通过将聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）共价地结合到蛋白质分子上，形成PEG蛋白复合物。
PEG修饰蛋白药物具有一定的优点，如延长药物在血液中的半衰期，增强溶解度和稳定性，降低免疫原性等。
然而，PEG修饰蛋白药物的质量控制对保证其药效和安全性至关重要。
本文将介绍PEG修饰蛋白药物关键质控方法的研究内容。
首先，对于PEG修饰蛋白药物的关键质控方法之一是蛋白质的PEG化程度的测定。
蛋白质的PEG化程度对其药效和稳定性有重要影响。
通常可以利用高效液相色谱（HPLC）技术或电泳技术来测定PEG化程度。
HPLC技术常用于测定PEG蛋白复合物中PEG的相对含量。
通过校正标准曲线，可以计算出样品中PEG的含量。
电泳技术则可用于测定PEG化蛋白与非PEG化蛋白之间的分子量差异，从而确定PEG化程度。
其次，PEG修饰蛋白药物关键质控方法的另一个方面是蛋白质的稳定性和活性检测。
PEG修饰可以改变蛋白质的结构和功能，因此需要对其稳定性和活性进行验证。
可以使用圆二色光谱（CD）、荧光光谱等技术来研究蛋白质的二级结构和三级结构的变化。
此外，可以使用酶活性测定、生物活性测定等方法来验证蛋白质的功能是否受到PEG修饰的影响。
此外，PEG修饰蛋白药物的质控方法还包括纯度和杂质的检测。
蛋白质的纯度是指样品中目标蛋白质的含量，常用的方法有SDS-、HPLC、质谱等。
杂质的检测包括有机杂质和无机杂质的检测。
有机杂质包括溶剂残留、杂蛋白等，可以通过液相色谱（LC）或气相色谱（GC）方法进行分析。
无机杂质如重金属离子等可以使用质谱等技术进行检测。
最后，PEG修饰蛋白药物的关键质控方法还包括溶解度和稳定性的研究。
由于PEG修饰可以增加蛋白质的溶解度，因此需要研究PEG修饰对蛋白质溶解度的影响。
稳定性是指蛋白质在制剂中的长期稳定性，包括在贮存和运输过程中的稳定性。
PEG的修饰作用
PEG的修饰作用京江学院药物制剂0702 3071158037 赵艳华摘要：聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。
自Davis1977年首次用PEG 修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，多个PEG修饰药物上市或在临床研究中。
PEG修饰具有半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等。
关键词:PEG(聚乙二醇)；修饰高分子聚乙二醇（PEG）由于其毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性，且生物相容性已获FDA认可，对蛋白质的改造具有无可取代的优势。
聚乙二醇化修饰技术通过共价键，将聚乙二醇与被修饰药物耦联，改善药物的理化性质和生物学活性，这种技术现已广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物。
1 PEG化学结构及性质1.1 PEG化学结构结构式CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH1.2 PEG性质【1】聚乙二醇系列产品通常情况下溶于水和多种有机溶剂，不溶于脂肪烃、苯、乙二醇等，不会水解变质，有广泛的溶解范围和优良的相容性、很好的稳定性、润滑性、成膜性、增塑性、分散性等。
系低毒物质，且无刺激性，属非离子型聚合物。
2 聚乙二醇修饰剂根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。
根据被修饰化合物包括蛋白质、多肽、单克隆抗体分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子结构以及其理化特性，公司采取不同的聚乙二醇化技术方法对这些化合物进行修饰【2,3】。
2.1随机修饰随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标，由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多，这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物，目前FDA批准的已经上市的聚乙二醇化新药多数为随机修饰的产物。
聚乙二醇修饰蛋白质类药物的研究现状与进展
聚乙二醇醇修饰蛋白质类药物的研究现状与进展摘要：高分子前药可以控制药物释放速度，降低小分子药物的毒副作用，减少抗药性，增强抗肿瘤药物的靶向性和选择性，提高多肽、蛋白质和核酸类药物的稳定性和有效利用率。
由于聚乙二醇(PEG) 具有与蛋白质相容的特性, 用其对蛋白质类药物进行化学修饰已经成为医学和生物工程领域的热门课题, 得到了广泛的研究和应用。
PEG 修饰的蛋白质类药物已经逐渐成为新一代高效、低毒的治疗药物。
关键词：聚乙二醇蛋白质修饰高分子前药PEG 为一种亲水、不带电荷的线性大分子, 当它与蛋白质的非必需基团共价结合时, 可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇, 避免抗体的产生, 或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。
蛋白质经PEG 修饰后, 分子量增加, 肾小球的滤过减少; PEG 的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解, 同时减少了抗体的产生, 这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长。
当然, PEG 修饰也会影响到蛋白质的生物学活性, 这种影响的大小与修饰剂、修饰条件及蛋白质本身的性质等有关。
目前, 国内外对PEG 修饰蛋白质类药物的研究主要集中于天冬酰胺酶、腺苷脱氨酶、干扰素、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、超氧化物歧化酶、水蛭素、尿激酶、血红蛋白、单克隆抗体等, 其中腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、粒细胞集落刺激因子1.天冬酰胺酶（ASP）L-天冬酰胺酶（ASNase）能够催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸，将其与其他化疗药物相结合是治疗白血病的一种有效手段，但是由于它在血液存留时间短，长期接受治疗的白血病病人需要经常注射。
而ASNase是从大肠杆菌提纯出来的，在重复注射的条件下容易发生危险的免疫病【１】。
PEG修饰后的Ｌ－天冬酰胺酶可以降低免疫原性，聚乙二醇天冬酰胺酶于１９９４年２月上市，是第二个被批准的聚乙二醇药物，用于治疗急性淋巴性白血病和恶性黑色素瘤。
近年来，新的梳状ＰＥＧ衍生物分子ＰＭ１３和ＰＭ１００也被用于蛋白质的修饰。
peg修饰蛋白 实验步骤
peg修饰蛋白实验步骤引言：PEG（聚乙二醇）修饰蛋白是一种常用的实验方法，通过将PEG与蛋白相互作用，可以改变蛋白的性质和功能。
本文将介绍PEG修饰蛋白的实验步骤，以帮助读者了解该方法的基本原理和操作过程。
一、蛋白的纯化与浓缩1. 选择目标蛋白：确定需要修饰的蛋白，可以是已知的重要蛋白，也可以是研究中的新蛋白。
2. 表达与纯化：根据蛋白的特性选择合适的表达系统，并进行蛋白的纯化。
常见的方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
3. 浓缩蛋白：使用浓缩方法（如超滤或醋酸铵沉淀）将纯化得到的蛋白浓缩至适当的浓度，以便进行后续的PEG修饰实验。
二、PEG修饰蛋白的实验步骤1. 选择PEG修饰试剂：根据需要修饰的蛋白特性和实验设计，选择合适的PEG修饰试剂。
常见的PEG修饰试剂包括NHS-PEG、Maleimide-PEG和Aldehyde-PEG等。
2. 准备修饰反应体系：将纯化得到的蛋白溶解至适当浓度，并在合适的缓冲液中加入PEG修饰试剂。
根据实验需要，可以加入其他辅助试剂，如还原剂或催化剂。
3. 进行修饰反应：将修饰反应体系在适当温度和时间下进行反应。
反应条件的选择应根据具体实验目的和蛋白特性进行优化。
4. 反应终止与蛋白的后续处理：将反应终止剂加入修饰反应体系，停止修饰反应。
根据实验需要，可以对修饰后的蛋白进行一系列的后续处理，如洗涤、浓缩或纯化等。
5. 验证修饰效果：通过一系列的实验方法，如SDS-PAGE、质谱分析等，验证修饰效果和修饰位点。
根据实验结果进行数据分析和解释。
6. 功能分析与应用研究：进一步研究修饰后蛋白的性质和功能变化，如抗原性的改变、稳定性的提高等。
根据实验目的，可以进行细胞实验、动物实验或体外试验等。
三、实验注意事项1. 实验条件的优化：根据蛋白的特性和实验目的，对实验条件进行优化，如修饰试剂的浓度、反应时间和温度等。
2. 蛋白的稳定性：在修饰过程中，一些蛋白可能会因为修饰试剂的加入而失去稳定性。
聚乙二醇修饰在蛋白药物领域研究进展
聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的研究进展摘要: 随着科学家对蛋白质工程技术的深切研究，聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一，取得愈来愈普遍的应用。
鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对其修饰位点进行分析鉴定成为科学研究的重点与难点。
本文要紧简述就PEG定点修饰的技术和PEG 修饰位点的分析检测方式，并展望了PEG修饰技术以后的进展趋势。
关键词：聚乙二醇；蛋白质药物；结构；蛋白质工程；修饰位点一、蛋白质药物的聚乙二醇修饰简介药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方式偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上是一种蛋白质工程分子修饰方式。
药物的聚乙二醇修饰可分为两个时期。
第一时期的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(<20000)。
但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳固性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。
以应用相对分子质量高(>20000)聚乙二醇修饰剂为特点的第二时期的修饰技术具有连接稳固、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳固性、更高的产品均一性和纯度。
修饰氨基多肽蛋白质分子参与PEG化反映的基团常为α-和ε-氨基,因此用于修饰氨基的单甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs)种类较多,可分为烷基化mPEGs和酰基化mPEGs两大类。
烷基化mPEGs,包括mPEG-醛、mPEG-三氟乙磺酸及mPEG-环氧化物等。
其中mPEG-醛的修饰条件温和,交联时不引入其他活性基团,在低pH下仅修饰N-结尾氨基,对活性阻碍较小,同时方便产物的纯化和鉴定,已用于G-CSF、IFN 及CD4-IgG等的修饰。
mPEG-三氟乙磺酸的修饰条件也较温和,对GM-CSF修饰后使其维持较好活性。
mPEG-环氧化物虽制备简单,但偶联物含活性羟基,易发生其他交联反映,修饰率也较低。
聚乙二醇在生化药物化学修饰中的应用
vivo and i n vit ro exposure to alpha2asarone.M utat Res, 1992,279(4):269.19Fautz R,Forster R,Hechenberger CMA.Report of a comparative study of DNA damage and repair assays in primary rat hepatocytes chemicals with five coded chemicals.M utat Res,1991,260:281.20杨永年,李庆天,唐玲芳,等.石菖蒲主要成分α2细辛醚致畸性研究.南京医学院学报,1986,6(4):248.21Salazar M,Salazar S,Ulloa V,et al.Teratogenic action of alpha2asarone in the mousel.J Toxicol Cli n Ex p,1992,12(3):149.22Wiseman RW,Miller EC,Miller JA,et al.Structure2activity studies of the hepatocarcinogenicities of alkenylbenzene derivatives related to estragole and safrole on administration to preweanling male C57BL/6J XC3H/HeJ F1,mice.Cancer Res,1987,47(9):2275.23Lopez ML,Hernandez A,Chamorro G,et al.Alpha2asarone toxicity in long2tern cultures of adult rat hepatocytes.Planta Med,1993,59(2):115.24甘俊,黄仁彬,林军,等.复方α2细辛脑长期毒性研究.广西医学院学报,1990,7(3):38.(收稿:1996-05-23)聚乙二醇在生化药物化学修饰中的应用周文孝 袁庆辉(驻马店463000济南军区生物制品药物研究所)摘要 目的:对聚乙二醇(PEG)2生化药物化学修饰法的实用性作一考查。
蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展
蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展作者：杨旭贡济宇来源：《中国当代医药》2012年第31期[摘要] 近年来，越来越多具有生物活性的蛋白多肽类药物被发现，因其生理功能上的高效性及专一性而广泛用于治疗各种疾病。
但由于其在体内易被降解，且生物半衰期短，使其应用受到了限制。
通过化学修饰的方法，可以延长蛋白肽类药物的生物半衰期，提高药效，降低副作用。
聚乙二醇能有效增加蛋白多肽类药物在体内的稳定性，本文就聚乙二醇共价连接修饰蛋白质及多肽类药物做一综述。
[关键词] 蛋白质；多肽；聚乙二醇化；研究进展[中图分类号] R914 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）11（a）-0016-03随着基因工程、生物制药及肽类药物固相合成技术的发展，许多极具开发和应用前景的多肽蛋白类药物逐渐受到关注，且在疾病的诊断、预防及治疗中占有越来越重要的位置。
但这类药物稳定性差，在生物体内半衰期较短，所以提高其在体内的稳定性成为研究焦点。
聚乙二醇（PEG）是中性、无毒、无免疫原性、有良好的生物相容性的高分子聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，当耦联到药物分子表面时，可改变其生物分配行为和溶解性，产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中被快速消除。
将蛋白肽类药物进行PEG修饰，可以提高药物在体内的稳定性，以改善体内半衰期，因而被广泛用于蛋白多肽药物的修饰，以改善该类药物在体内的性质。
本文对PEG的性质、修饰策略及研究现状等方面进行综述。
1 聚乙二醇的性质及选择PEG是经环氧乙烷聚合生成的一类高分子化合物。
它不仅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、乙腈和乙醇等有机溶剂。
通过化学反应先在PEG上连接“小分子臂”，再通过连接臂与化合物相接，这一过程称为PEG的活化，活化后的PEG即为PEG修饰剂。
本文总结了近年来新兴的几种聚乙二醇修饰剂，见表1。
PEG修饰剂的选择决定了修饰后药物的性质，一个理想的PEG修饰剂至少满足以下条件：（1）无毒，无免疫原性且生化性质稳定。
蛋白质的化学修饰
蛋白质的化学修饰蛋白质化学修饰技术是现代生物技术发展的一个重要方向，以聚乙二醇(PEG)为修饰剂和以蛋白质为修饰剂是该技术的两个主要类型。
PEG修饰技术发展成熟，已经有几种PEG-蛋白质药物经过FDA 认证。
为了有效地检测和分离修饰产物，本论文首先用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效凝胶过滤、高效反相层析方法检测PEG修饰蛋白的组成。
随着PEG分子量的减少和被修饰蛋白分子量的增大，这三种常用方法的分辨率都相应降低。
重点考察了PEG修饰蛋白的SDS-PAGE 电泳过程，发现不带电的PEG分子在SDS 胶束的作用下参与了电场运动，从而导致分辨率下降。
改用没有SDS 的非变性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)后分辨率显著提高，未与白蛋白连接的PEG不参与电场运动，未修饰HSA和不同修饰程度的PEG-HSA偶联物得到有效的检测和分离。
进行了膜分离PEG修饰和未修饰蛋白质(和多肽)的考察。
被修饰物质的分子量和结构对分离效果有影响，低分子量的小肽可以通过膜分离与PEG-小肽偶联物完全分开。
传统的PEG反应方法中，产物是未修饰小肽(5％)、单修饰产物(42％)、二修饰和多修饰产物(53％)的混合物，而将膜分离与PEG修饰反应耦合，及时将PEG修饰产物移除，小肽100％转化成为单修饰的目标偶联物。
说明反应和分离耦合是提高PEG修饰反应产量和降低成本的有效途径。
从理论上讲，与PEG修饰相比，蛋白质类修饰剂具有代谢途径明确、可以提供靶向性和其他的生物活性的优点。
但是，蛋白质-蛋白质偶联反应的产物不均一、产物评价困难限制了其发展。
本文以戊二醛为交联剂采用人血清白蛋白(HSA)修饰血红蛋白，对修饰过程进行了探索。
考察了人血清白蛋白和血红蛋白的戊二醛一步交联反应，发现pH 是影响反应的关键因素。
在蛋白质的等电点附近发生蛋白质自身的聚合反应，而在两种蛋白质的等电点的平均值附近，两种蛋白质的偶联反应被促进。
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蛋白质药物聚乙二醇修饰技术简介
近年来，随着蛋白质药物的聚乙二醇修饰技术的发展，聚乙二醇化药物得到了广泛的应用。
目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市，临床医疗效果优异，市场上也表现出了良好的业绩。
同时还有数十种聚乙二醇化蛋白质药物处在临床或临床前研究阶段。
聚乙二醇简介
聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）是一类聚醚类聚合物。
随着平均分子量的不同，性质也产生差异。
当分子量小于1000 Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是白色固体。
固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。
聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。
聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106 Da，本身的免疫原性也很低。
临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗时，未发现抗聚乙二醇抗体产生。
聚乙二醇是经美国食品药品管理局（FDA）批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。
聚乙二醇修饰又称分子的PEG化（pegylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。
将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。
聚乙二醇修饰反应类型
在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。
活化的聚乙二醇通过与蛋白质分子上的氨基酸残基进行化学反应而实现与蛋白质的偶联。
这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>α-氨基>ε-氨基>羧基（羧酸盐）>羟基。
以下按照蛋白质分子上与聚乙二醇偶联基团的不同进行分类介绍。
蛋白质分子表面的游离氨基具有较高的亲核反应活性（主要为L赖氨酸的ε-氨基和末端氨基），一般不处于活性中心部位，因而成为化学修饰中最常用的被修饰基团。
这些被修饰基团主要是赖氨酸的α-、ε-氨基和末端氨基。
同时用于氨基修饰的PEG 的种类也较多，其中氰脲酰氯法、烷基化和酰基化是常用的氨基修饰方法。
（反应方程式如Eq. 1-Eq.3所示）
（1）
（2）
（3）氨基修饰最常用的修饰剂为MPEG-SS、MPEG-SC、MPEG-SPA、MPEG-NHS、MPEG-CHO和MPEG-ALD等。
巯基修饰
半胱氨酸上的巯基通常处于蛋白质的内部，位于蛋白质表面的自由巯基远少于氨基但是位置确定，因而可针对那些对活性影响不大、呈游离状态的巯基进行定量、定点修饰。
若天然蛋白中不含半胱氨酸，则可通过基因工程改造方法在蛋白的特定区域引入一个或一个以上的自由半胱氨酸，对蛋白质进行定点修饰，这一方法不但能够实现高度选择性修饰，而且能够减少蛋白生物活性的丧失，并降低免疫原性。
最常用的修饰剂为MAL-PEG。
（4）
羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。
首先将聚乙二醇分子中的端基转化为氨基，再在羧二亚胺存在的条件下与蛋白质的羧基结合，但同时也易产生其它的交联反应。
近年来发现PEG-酰肼可与羧基特异结合。
在EDC 存在下，酸性条件（pH=4.5～5）时，蛋白质中氨基被质子化避免了交联反应的发生。
（5）
PEG化的历史
第一代PEG化技术局限于应用低分子量官能化聚乙二醇单甲醚（mPEG）。
这类官能化PEG的分子量通常小于20,000，并且含有大量的二醇（Diol）杂质。
在第一代PEG化技术中，PEG修饰剂通常含有琥珀酸琥珀酰亚胺基、碳酸琥珀酰亚胺基等，通过酯键或三嗪环将PEG与药物分子偶联。
这种方式的偶联属于非特异性反应，因为这些官能化PEG会同药物分子上的羟基、氨基、巯基等同时反应，从而不能完成定向链接。
第二代PEG化技术比第一代有了极大的进步。
这得益于官能化PEG技术的发展。
首先，由于技术的进步，得到了高分子量的官能化PEG，并将二醇（Diol）的含量降低至5%以下。
新型官能化PEG更具选择性，带有醛基、羧基、氨基、乙烯基、异氰酸基等活性基团，可与药物分子上的羟基、氨基、巯基等进行选择性的反应，从而完成定向链接。
同时出现了双臂及多臂PEG，具有更大的分子体积和特殊的分子形态，更有利于对药物分子等的修饰与改性，达到更优的综合效果。
PEG修饰剂的选择
对修饰剂的选择主要考虑以下5 个方面: （1）PEG的相对分子质量（Mn）和分子量分布系数（PDI）：已有的研究证明，修饰的蛋白药物在体内的作用时间与偶联的PEG数量和Mn 成正比，在体外的生物活性与偶联的PEG数量和Mn 成反比，应用Mn 过大的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性。
以往采用低Mn（< 20,000）的PEG修饰蛋白药物，结果显示出修饰PEG 对蛋白质药物的修饰虽然有效地提高药物的水溶性，降低毒副作用，延长药物
在血液中的半衰期，但是在提高靶向性和增加疗效等难题上较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质改变，现在普遍采用Mn 大于20,000 的高Mn PEG作为修饰剂。
另外，PEG修饰剂的PDI要求越小越好，分子量分布越宽将越不利于修饰后蛋白质药物的分离纯化。
（2）修饰位点和PEG修饰剂的官能团：修饰位点的选择要根据蛋白质构效关系分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。
PEG 修饰剂与氨基酸残基反应的特异性依赖于修饰剂的化学性质与修饰位点的选择。
对于修饰反应的特异性，需要选择带合适官能团的PEG修饰剂。
（3）PEG修饰剂的分子链结构：除了聚乙二醇的分子量聚乙二醇的支链特性会对蛋白质药物的许多药代动力学参数造成影响，支链特性不同的聚乙二醇化分子拥有不同的生物特性。
以PEG IFNα-2b为例，当PEG化采用小分子直链PEG，半衰期约为40小时，药物全身分布，按体重给药，经FDA批准用于治疗慢性丙型肝炎。
PEG IFNα-2a为大分子支链PEG IFN，半衰期约为80小时，药物可浓聚于靶器官如肝脏，无需按体重给药，被FDA批准用于慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎的治疗。
展望：
近年来，随着蛋白质药物PEG化的迅猛发展，已有十余种PEG修饰的蛋白质药物上市，同时还有数十种PEG化蛋白质药物处在临床或临床前研究阶段。
相信在不久的未来，PEG 修饰技术将得到更加深入的研究和更加广泛的应用。
聚乙二醇修饰剂（或称活化聚乙二醇（activated PEG）、官能化聚乙二醇（functional PEG）、活性聚乙二醇（active PEG）、聚乙二醇衍生物（PEG derivative）等）是聚乙二醇化研发和生产不可或缺的原料。
厦门赛诺邦格生物科技有限公司专业提供各类聚乙二醇修饰剂，同时提供定制合成和聚乙二醇化服务。
赛诺邦格的聚乙二醇修饰剂产品主要包含：官能化聚乙二醇单甲醚、双官能化聚乙二醇、异端官能化聚乙二醇、官能化两臂聚乙二醇、官能化四臂聚乙二醇、主链官能化聚乙二醇、新型官能化两臂聚乙二醇、官能化Y型聚乙二醇、官能化环状聚乙二醇、官能化支化聚乙二醇。
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