RT-PCR常用引物序列
RT-PCR
适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有 PolyA 尾巴。）由于 Oligo dT 要结 合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少 量降解也会使全长 cDNA 合成量大大减少。
RT－PCR
RT- PCR 即逆转录 PCR，是将 RNA 的逆转录（RT）和 cDNA 的聚 合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR 技术灵敏而且用 途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中 RNA 病毒的 含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。
中文名 逆转录 PCR 外文名 reverse transcription PCR 性质 聚合酶链式反应广泛应用的变形 模板 一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA oligo 多聚体，相当于 mRNA 引物 AMV RT
基因序列已知的情况。
3RT-PCR 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于 mRNA 引物 AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 dNTPs：脱氧核苷酸 RNase：RNA 水解酶 PCR Buffer：RT-PCR 缓冲液 MgCl2：2价镁离子
(2) 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷 酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性 温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的 DNA 片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度 低3—5℃的条件下进行。
（3）PCR 扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷 贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦 PCR 反应进入几何级数 的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。 从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产 物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用 TaqDNA 聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶 序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想 情况。
RT-PCR实验原理与步骤
RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。
【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。
4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。
【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。
延伸时间因目的序列长度不同而不同。
cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。
2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。
3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。
CXCL12
CXCL12/CXCR4轴通过调节自噬促进乳腺癌细胞对多柔比星的化疗抗性①李霞梁海珊程学②段哲③（海南省中医院输血科，海口 570100）中图分类号R737.9 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）07-1446-06［摘要］目的：探究CXCL12/CXCR4轴在乳腺癌细胞多柔比星（Dox）化疗抗性中的作用及相关机制。
方法：体外培养乳腺癌细胞系MCF-7，通过MTT实验检测在CXCL12作用下乳腺癌细胞对Dox的敏感性变化，RT-PCR和Western blot检测上述细胞中CXCL12受体CXCR4与CXCR7的mRNA及蛋白的表达水平；采用siRNA干扰技术靶向沉默乳腺癌细胞中CXCR4表达，RT-PCR和Western blot检测转染效率后，依次使用MTT、Annexin V-FITC/PI流式细胞术及Western blot明确在CXCL12作用下沉默CXCR4表达对Dox介导的乳腺癌细胞的抑制率，凋亡、自噬及PI3K/Akt信号通路表达的影响。
结果：CXCL12能够通过促进CXCR4的表达，提高乳腺癌细胞对Dox的化疗抗性；转染siRNA能够显著抑制乳腺癌细胞中CXCR4的mRNA及蛋白的表达水平；而沉默CXCR4能显著改善CXCL12作用下的乳腺癌细胞对Dox的敏感性，提高Dox诱导的细胞凋亡率，并通过抑制自噬相关蛋白LC3B与Beclin1表达，下调乳腺癌细胞中的自噬水平；同时，沉默CXCR4能通过抑制PI3K/Akt信号通路中PI3K蛋白表达及Akt蛋白磷酸化水平，下调抗凋亡蛋白BCL-2，促进凋亡相关蛋白Bax与cleaved Caspase-3表达。
结论：CXCL12/CXCR4在乳腺癌细胞Dox耐药性中具有重要作用，而沉默CXCR4表达能通过下调MCF-7细胞的自噬水平，提高Dox诱导的细胞凋亡，从而改善肿瘤细胞对Dox的敏感性。
［关键词］趋化因子12（CXCL12）；CXCR4；乳腺癌；多柔比星；自噬CXCL12/CXCR4 axis promotes chemotherapy resistance of breast cancer cells to doxorubicin by regulating autophagyLI Xia， LIANG Haishan， CHENG Xue， DUAN Zhe. Department of Blood Transfusion， Hainan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Haikou 570100， China［Abstract］Objective：To explore the role of CXCL12/CXCR4 axis in anti-doxorubicin （Dox） resistance of breast cancer cells and its related mechanism. Methods：Breast cancer cell line MCF-7 was cultured in vitro. The sensitivity of breast cancer cells to Dox was detected by MTT assay. The mRNA and protein expression levels of CXCL12 receptor CXCR4 and CXCR7 were detected by RT-PCR and Western blot. siRNA interference was used to silence CXCR4 expression in breast cancer cells. RT-PCR and Western blot were used to detect the transfection efficiency. MTT， Annexin V-FITC/PI flow cytometry and Western blot were used to determine the effects of CXCR4 silencing on DOX mediated proliferation inhibition， apoptosis， autophagy and PI3K/Akt signaling pathway expres‐sion in breast cancer cells. Results：CXCL12 could enhance the chemoresistance of breast cancer cells to Dox by promoting the expres‐sion of CXCR4. siRNA could significantly inhibit the expression of CXCR4 mRNA and protein in breast cancer cells. Silencing CXCR4 can significantly improve the sensitivity of breast cancer cells to Dox and increase the apoptosis rate mediated by Dox， and down-regu‐lation the autophagy level in breast cancer cell by inhibiting the expression of autophagy related proteins LC3B and Beclin1. At the same time， silencing CXCR4 could inhibit the phosphorylation level of PI3K and Akt protein in PI3K/Akt signaling pathway， reduced the anti-apoptotic protein Bcl-2，promoted apoptosis related protein Bax and cleaved caspase-3 expression. Conclusion：CXCL12/ CXCR4 played an important role in Dox resistance of breast cancer cells. Silencing CXCR4 expression could improve the sensitivity of tumor cells to Dox by down regulating autophagy level and increasing Dox induced apoptosis.［Key words］Chemokine 12 （CXCL12）；CXCR4；Breast cancer；Doxorubicin；Autophagy乳腺癌是世界范围内最常见的肿瘤之一，也是女性癌症死亡的首要原因［1-2］。
RTPCR
RT-PCR试剂配制(1)O.1％DEPC水：l ml DEPC+1000 ml双蒸水，高压灭菌后用于配制RNA提取的相关试剂。
如果浸泡RNA提取的相关器皿，则应在DEPC水配制后立即使用。
(2)10 mg·ml-1溴乙锭：1 g溴乙锭溶于100 ml去离子水中，避光保存，溴乙锭的工作浓度为0.5µg·ml-1。
(3)5×TBE储存液:Tris 54g,硼酸 27.5g，EDTA pH8.0(固体NaOH调,先配100ml) 20ml，定容到1L。
(每种药品都用蒸馏水先溶解，都比较难溶，再互溶效果好点。
)0.5×TBE工作液是5×TBE储存液稀释10倍。
(4)1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1µL(终浓度为O.5µg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。
凝胶的厚度一般在3-5mm之间。
在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳。
RNA提取前的准备1.组织保存：小鼠处死后脏器迅速冻存于液氮罐中。
2. 研钵，剪刀及镊子的处理1) 自来水反复冲洗；2) 去污剂或者洗涤灵冲洗；3) 自来水反复冲洗；4) 用锡箔纸包裹研钵研棒等，180度干烤4－8小时，除去RNAase3. 枪头及EP管（0.5ml,1.5ml，5ml）的处理1) 0.1%DEPC水浸泡1～2天；2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中；3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干（需几天）。
RT-PCR方法总RNA的提取：1.组织匀浆：先放入液氮入碾钵内，把分装放入液氮中的一份肝脏入碾钵内，碾磨，边加液氮边碾磨。
用DEPC水处理的1.5ml的EP管刮下碾钵上的肝脏，加入1ml RNAVzol混匀。
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
反转录RT-PCR的内参如何选择？
反转录RT—PCR的内参如何选择？RT—PCR就是将RNA先反转录为cDNA，再将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段。
用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。
1）随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA。
适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应。
主要用于单一模板的RT-PCR反应。
2）Oligo dT:适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA 和tRNA不具有PolyA尾巴。
）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少.oligo(dT) capture多聚胸腺嘧啶-核苷酸捕捉实际上指的是用Oligo（dT）特异结合到mRNA上PolyA尾端的技术，以此技术可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来，通常用于mRNA的反转录3) 基因特异引物：与模板序列互补,适用于目的序列已知的情况.实时PCR也就是qPCR，它的基本原理与PCR也是一样的，只是在体系中加入荧光指示，可以对PCR的模板进行定量。
一种是加入荧光染料SYBR Green，SYBR Green会嵌入双链DNA的小沟,且只有在嵌入小沟时才会发出荧光，荧光定量PCR没进行一个循环就会对产物进行一次检测，通过检测每个循环后荧光强度(间接得知DNA的量）从而检测整个PCR的过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
SYBR Green不具有特异性，对结果稍有影响。
另一种是加入荧光探针T aq man，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，T aqman探针在PCR体系中会与目标片段杂交，而在PCR的Extension阶段Taq酶以一条链为模板合成目标片段，此时T aq酶的5'－3’外切酶活性将结合在模板上的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
RT-PCR常用引物序列
RT-PCR常用引物序列RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kbβ-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62kbβ-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG ATGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kbGAPDH 人有意义链 GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kbGAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kbDynein 小鼠有意义链 GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 12.3 kbPolymerase ε人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kbPolymerase ε人有意义链 AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GATGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kbTuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG ATCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb*引物不会扩增假基因PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）HIV gag region 病毒 SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAATSK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kbβ-globin 人 (29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA(34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kbβ-globin 人 (31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG(34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb序列来源：nvitrogen 公司大家用什么稀释引物?引物应该用TE稀释。
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
RT-PCR实验方法简介-PCR
RT-PCR实验方法简介RT-PCR定义：是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。
RT-PCR流程简介一、抽提RNA：1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用；操作人员戴手套；器械专用。
2、材料的准备组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融。
3、确认RNA的质量检测RNA溶液的吸光度：OD260/OD280=1.8－2.0RNA的电泳图谱：28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。
二、反转录：单管一步法:反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR 扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。
两步法:反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。
三、PCR：1、参照基因PCR参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍；参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参；参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参；由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。
2、目的基因PCR典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
RT-PCR实例：1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异3、实验步骤：设计ACTIN及G1基因的引物；分别抽取野生型Ws及突变体m 1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA；电泳检测，估计R NA总量；取1ug左右的RNA进行反转录；取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－2 5个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。
TR-PCR
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A )RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
RT-PCR引物设计原则和方法
RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin 中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
此窗口可以链接到―引物搜索‖、―引物编辑‖以及―搜索结果‖选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择―PCR primers‖，―Pairs‖，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。
点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在―引物窗口‖中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为―None‖为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
引物设计不求人！手把手教你设计RT-qPCR引物！
引物设计不求⼈！⼿把⼿教你设计RT-qPCR引物！RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应，是⼀种在DNA扩增反应中，以萤光染⾊剂检测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的⽅法。
OK～这⾥对RT-qPCR的原理，应⽤及数据分析就不再赘述了，因为今天我们主要讲的是如何设计出好的PCR引物。
相信科研⼩伙伴们都已经⽤过Pubmed来设计引物了，基本就是 “傻⽠式操作”就解决了！但这⾥还需提醒⼩伙伴们两点：1. 需跨越⾄少⼀个外显⼦连接（⼀般我们⽤来做RT的RNA都是通过Trizol抽提法分离出来的，为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来，就要⾄少跨越⾄少⼀个exon-exon junction 了）。
2. 不要忘记选对“物种”！（这⾥以⼈种⽰例）但是Pubmed设计出来的引物⼀般不尽如⼈意，⽐如说引物之间存在极⼤的互补性，3’端的互补重叠，形成引物⼆聚体等等。
因为⽤Pubmed设计引物本⾝能设置的参数条件就很少，所以它才是最简单的。
所以，今天我要给⼤家介绍两款实⽤的软件，Primer Premier 6.0 和 Oligo 7.0。
今天主要讲讲第⼀款，⾄于第⼆款，改天再聊啦！当然，这两款软件，要想⽤全功能版本，都是需要付费的哦！不过...，我们伟⼤的祖国有强⼤的某宝，这⾥就不多说了哈。
好了，我们进⼊今天的正题……（说了这么多废话，终于要进⼊正题了！！！）⾸先，我们选⼀个基因举例来说，PPARA，⾄于为什么会选这个基因呢？因为啊，PPAR⽬前是肿瘤学研究中的⼀个“明星基因”，它的全称是Peroxisome proliferator-activated receptor, 即过氧化物酶体增殖物激活型受体，⽬前发现有三种亚型，PPAR a，PPARbeta/delta，PPAR r。
好吧…….听着好复杂的样⼦啊！总之，管它到底是什么呢，下⾯来说说它的引物如何设计。
逆转录-聚合酶链(RT-PCR)实验的具体步骤及方法
逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
一、总RNA的提取见总RNA的提取相关内容。
二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。
在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。
β-actin mouse primer 序列 -回复
β-actin mouse primer 序列-回复在分子生物学和基因表达研究中，基因的测定和定量是非常重要的。
为了确定一个基因的表达水平，研究人员通常使用RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）技术来扩增目标基因的片段，并对扩增的产物进行测定和定量分析。
在RT-PCR中，引物是扩增过程中的关键因素之一。
β丝氨酸（β-actin）是一种常用的参考基因，用于在实验中测量和标准化其他基因的表达水平。
首先，我们需要知道β-actin 基因的序列和相应的引物序列。
β-actin 是一种高度保守的测序，其序列在不同物种之间的变化很小。
在小鼠中，β-actin 基因的序列如下：5'-ATGGATGATGATATCGCCGCGCTG-3'（前向引物）5'-ATGAAACGCTCGGTCAGGATCTTCA-3'（反向引物）这些引物序列可以直接用于RT-PCR 扩增β-actin 基因片段。
下面将详细介绍一步一步的实验过程。
第一步是RNA的提取。
假设我们想要从小鼠组织中提取总RNA。
我们可以使用商业化的RNA提取试剂盒，按照说明书的指导进行操作。
一般情况下，将组织样本置于离心管中，加入适量的试剂并破碎组织，然后提取总RNA。
提取的总RNA可以通过紫外光比色法或琼脂糖凝胶电泳进行质量和纯度的检测。
第二步是反转录过程，将总RNA转录成cDNA。
反转录实验要求使用逆转录酶和适用的引物。
在这里，我们将使用以下反转录试剂：- M-MLV逆转录酶- 随机引物- dNTPs- 反转录缓冲液- RNase抑制剂- DEPC水首先，在冰上配置逆转录的反应混合液。
将以下试剂加入1.5mL离心管中：- 2μg总RNA- 1μL随机引物- 1μL dNTPs- 1μL M-MLV逆转录酶- 1μL RNase抑制剂- 2μL反转录缓冲液- 13μL DEPC水混合并离心管轻轻旋转。
然后，将反应混合液加热至65C离解RNA二级结构，然后冷却至42C。
细菌引物
主要纤维降解菌：Table 2 Primer sequences for PCR of rumen bacteria瘤胃细菌Rumen bacteria引物序列Primer sequence( 5'—3')退火温度Annealing temp/（℃）扩增片段Amplification size / bp细菌16S rDNA V3 Bacterial 16S rDNA V3上游：CCTACGGGAGGCAGCAG下游：ATTACCGCGGCTGCTGG54 181产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogene 上游：GGCGGGATTGAATGTACCTTGAGA下游：TCCGCCTGCCCCTGAACTATC60 204黄色瘤胃球菌Ruminococcus flave faciens 上游：GATGCCGCGTGGAGGAAGAAG下游：CATTTCACCGCTACACCAGGAA60 286白色瘤胃球菌Ruminococcus albus 上游：GTTTTAGGATTGTAAACCTCTGTCTT下游：CCTAATATCTACGCATTTCACCGC63 270细菌16S rDNA引物序列参考Muzyer等[16]，其他引物序列参考王加启[17]。
主要蛋白降解菌：表4 特定细菌RT-PCR定量分析引物信息表项目引物序列（在序列中位置）退火温度参考文献或参照序列产物嗜淀粉瘤胃杆菌Ruminobacter amylophilus F 5’-TGA CCG CCT GGG GAG TAC GG -3’R 5’-TTG CGC TCG TTG CGG GAC TT -3’60℃王梦芝等，动物营养学报2010，22(2):327-334237bp牛瘤胃链球菌Streptococcus bovis F（856）5'- AAG GCT GAA ACT CAA AGG -3'R（1102）5'- GTG CCC AAC TCA ATG ATG GCA ACTA -3'52℃Streptococcus bovis 47MP16S rRNA EU075044.1 b247bp溶纤丁弧菌Butyrivibrio f ibrisolvens F 5’- TAACA TGA GA GTT TGA TCCTGGCTC-3’R 5’- CGTTACTCACCCGTCCGC -3’58℃李旦等，2008 c136bp栖瘤胃普雷沃氏菌Prevotella ruminicola F 5’- CCT TAT CTT GAG TGA GTT -3’R 5’- CTG ATG GCA ACT AAA GAA -3’53℃Tajima等，2001 c485bp。
PCR内参：选还是不选？,PCR内参,RT
PCR内参：选还是不选？,PCR内参,RT生物帮> 专题> 实验技术> 分子> PCR内参：选还是不选？导读：内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。
常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。
本专题就PCR实验中遇见的有关于内参的一些问题作出总结，以供读者参考。
PCR内参基因介绍GAPDH简介内参基因β-Actin简介实时荧光定量PCR 中内参基因的选择内参基因的概念和作用PCR内参基因介绍基因表达转录分析中内参基因的选择目前基因表达的转录分析多采用单一看家基因作为内参来校正目标基因的表达量.实验中以人肝癌BEL-7402细胞为研究对象，应用[详细]海带配子体18S rRNA 基因作为内参基因的应用通过基因克隆和序列测定,获得了海带( Laminaria japonica) 配子体的18S rRNA 基因序列,其长度为1 716bp ,GenBank 登录号为EU293553。
以蓝[详细]白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段作为基因表达内参目的获取白纹伊蚊β2肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。
方法根据昆虫β2肌动蛋白核苷酸序列[详细]常用的内参基因及其使用范围包括GAPDH 、β- actin(BETA-actin) 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。
[详细]常用的β-actin 引物序列常用的β-actin 引物序列[详细]RT-PCR常用引物序列引物应该用TE稀释。
oligo在酸性条件下是不稳定的，容易降解，如果用水溶解引物，无法保证pH值，如果合成引物纯化不好，造[详细]PCR内参常见问题汇总内参能跑出来但为何我的cDNA总是不稳定？我要做荧光定量试验，师姐做的定性，我能共用RT-PCR电泳照片有问题qPCR 目的基因与内参是不是要在同样体系里扩增斑马鱼的内参基因组怎么选择啊绝对定量需要用到内参基因吗选择内参基因的原则PCR内参常见问题汇总RT-PCR内参基因选择：除了β-actin还能用什么？实时定量PCR试验中，内参对于实验具有重要意义。
分析 Rt-PCR
分析 Rt-PCRPCR 全称聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），指利用 Taq 和/或 Pfu 核酸酶惊醒的体外特异性扩增某特定核算序列Rt-PCR 一般指反转录 PCR （Reverse Transcription PCR）其实就是将 PCR 与反转录结合，这样就可以获得多克隆的某一特异的RNA 片段（通常是 mRNA）。
首先将提取的 RNA 逆转录为 cDNA ，之后与常规 PCR 全都。
引物与常规 PCR 没有太大不同（序列特异性引物或随机引物）有时候会用 mRNA 的特异性引物 Oligo dT（针对 mRNA 的标志性 poly - A 尾）。
通常Rt-PCR 是为了分析细胞中蛋白质表达状况，会以细胞中自然表达的 beta-actin 作为内参分析蛋白质表达状况（beta-actin 认为是管家基因，在同种细胞中表达恒定）qPCR 指荧光实时定量 PCR （Quantitative real-time PCR），有时也会被称作实时/定量 PCR （Rt-PCR）。
qPCR 使用一种特别的探针—— Taqman 探针，其结构为一个 RNA 探针，两端分别加上一个发光基团 R 和一个吸光基团 Q 。
而且 qPCR 不使用 Taq 聚合酶，由于 Taq 缺乏其他 DNA 聚合酶拥有的 5 - 3 外切酶结构域及其即时矫正机制。
简洁说，就是rt和q都是常规PCR的变种。
此时R与Q同在探针上，距离较近，R产生的荧光被Q汲取，所以不显出荧光；当互补链DNA合成时，DNA聚合酶向下游移动，其5 - 3外切酶结构域就会切割探针，依次释放出R和Q。
自由的R与Q距离较远，相互之间没有互作，所以不会影响R的荧光。
定义新参数Ct值（Cycle threshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经受的循环数。
阈值通常设定为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（为什么这么设定？可能只是商定俗成吧我不了解）。
RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳原理与结果
RT-PCR反应程序
(1) 42℃30min， (2) 94℃3min， (3) 94℃变性3min，
(4) 94℃变性30sec，
(5) 52 ℃退火30sec， (6) 72 ℃延伸1min。 (7) goto(4)repeat29, （8）72 ℃延伸10min。
（9）hold at 4℃ 。
cDNA PCR扩增
1
1 1 12 25
DEPC-H2O
Total
3.6
20
cDNA第一链合成反应
实验目的
了解RT-PCR的基本原理。 熟悉RT-PCR的常规步骤。 掌握琼脂糖凝胶电泳技术。
实验要求
掌握PCR技术。 学会操作PCR仪。 熟悉琼脂糖凝胶电泳技术。
实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年 代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、 产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于 数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判 断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到 的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域 中的一项革命性创举和里程碑。
实验原理
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异 性是由两个人工合成的引物序列决定的。在DNA聚合酶催 化的一系列合成反应中，用两段寡核苷酸作为反应的引物。 一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分 别与模板DNA两条链上的各一段序列互补；而这两段模板 序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先是 在摩尔数过量的两段寡核苷酸及4种dNTP存在下，将模板 进行加热变性。随之将反应混合物冷却至某一温度，使引 物与它的靶序列进行配对，称为退火。然后，退火引物可 在DNA聚合酶作用下进行延伸。上述过程是由温度控制的。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。
设计RTPCR引物方法
设计RT-PCR引物方法要鉴定某一个基因在mRNA水平上的表达，需要使用Q-PCR的方法。
引物设计是很重要的一环，要进行Q-PCR时，获得引物的途径有很多种，其中最为方便的是使用NCBI和primer bank，首先介绍这一方法：比如你要检测某药物对小鼠细胞中IL-2的表达影响，通过Q-PCR检测，要设计引物。
①登陆NCBI，选择gene，在选框中输入 IL-2 mus（搜索小鼠IL-2基因）点击搜索获得结果如下：选择第一个基因，打开，可以获得gene的ID利用primer bank和ncbi的gene ID就可以获得前人已经设计好的引物②登陆primer bank （），按下图选择NCBI gene ID 选择物种mouse ，在 for text中输入前面获得的你要检测基因的ID （NCBI的编号）点击submit 查询，获得如下结果可以看到其它人设计的好几对引物，基本上是通过实验验证的，做Q-PCR的话直接拿来用就行了，点击绿色高亮的链接可以看到其他人使用这对引物做Q-PCR获得的结果。
二、自己设计Q-PCR引物方法比如要检测CXCR3的表达，做Q-PCR的扩增目的条带在100bp左右，如果半定量的话（通过跑胶定量）扩增产物一般400bp左右①登陆NCBI，选择gene，在选框中输入 CXCR3 mus（搜索小鼠CXCR3基因）点击搜索点击打开将网页往下拖到NCBI reference sequence 选择箭头所示mRNA 序列打开链接往网页下方拖动，可以看到CDS，点击CDS（编码蛋白区）出现如下界面，高亮部分为CDS去ATG起始密码子TAA终止密码子复制CDS区及其附近部分序列，如果要提取基因的话需要完全包括CDS区，如果只是检测的话，比如半定量的话就没必要全部包括。
打开primer 5 软件，新建一个DNA序列将复制的序列粘贴到选项框中，点击oK序列就导入了primer 5中，然后单击箭头所指primer，进入引物设计界面界面如下，点击search，使用primer自动寻找引物功能进入界面后，分别按下图选取所需要的参数，PCR product size 使用默认值即可，primer length一般在20bp左右比较合适点击OK后进入如下界面，点击OK出现如下界面，点击rating，按打分排列，打分是100分制，分值越高引物越好，根据自己试验目的，选择打分高的，产物片段400bp左右的引物对，并且Tm温度最好在60以上，有义链和反义链Tm值靠的越近越好，最好不要超过2摄氏度，下图中Tm行中蓝色字体表示有义链的Tm值，红色字体表示反义链Tm值，PCR 退火温度一般设置比Tm值低5摄氏度。
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RT-PCR常用引物序列
RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）
β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGA TC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kb
β-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 0.62kb
β-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG A TGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kb
GAPDH 人有意义链GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kb
GAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kb
Dynein 小鼠有意义链GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 12.3 kb
Polymerase ε 人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kb
Polymerase ε 人有意义链AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GA TGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kb
Tuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb
18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG A TCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb
*引物不会扩增假基因
PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）
HIV gag region 病毒SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAAT
SK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kb
β-globin 人(29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA
(34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kb
β-globin 人(31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG
(34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb
序列来源：nvitrogen 公司
大家用什么稀释引物?
引物应该用TE稀释。
oligo在酸性条件下是不稳定的，容易降解，如果用水溶解引物，无法保证pH值，如果合成引物纯化不好，造成偏酸的话，引物过一定时间就会降解而不能用了。
而且，高纯水本身就偏酸，也不利于储存。
所以应该按标准操作，溶解引物在1XTE里，这样可以有Buffer保证pH 7.5-8，引物才能长久保存。
如果要更长期的保存，最好是干粉。