真菌通用引物和ITS引物序列
多样性扩增引物选择—ITS
多样性扩增引物选择—ITS上篇给⼤家介绍了如何选择合适的16S扩增引物，那么作为研究真菌的常⽤⽅法—ITS扩增，引物的选择同样是关键。
1ITS简介ITS(Internal Transcribed Spacer)，内源转录间隔区，分为两个区域：ITS1和ITS2，ITS1位于真核⽣物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于真核⽣物rDNA序列5.8S和28S之间。
ITS对区分所有真菌有72%的成功率，因此ITS扩增是⽬前研究真菌的常⽤⽅法之⼀。
在2011年，ITS被正式确定为区分真菌的条形码，并于2012年发表在PNAS上[1]。
图1 ITS区域⽰意图在真核细胞中，28S核糖体⼤亚基rRNA基因（LSU）是某些真菌常⽤的系统发育marker，在早期分化谱系和⼦囊菌酵母中具有较好的物种分辨率，但在其他⽅便略低于ITS；18S核糖体⼩亚基rRNA基因（SSU）进化速率⽐较保守，在系统发育中较适⽤于种级以上阶元的分类，其同源基因16S是细菌的鉴定基因，但18S在真菌中的⾼变区较少；ITS长度约为500bp，属于中度保守的区域，其保守性基本上表现为种内相对⼀致，种间差异⽐较明显，表现出极⼤的序列多态性，被⼴泛应⽤于⽣物种间系统发育和研究。
2引物的选择ITS具有⾼拷贝数（≥200个），长度短（600-800bp）的特点，利⽤通⽤引物很容易被扩增出来；包含保守与变异序列，可根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进⾏特异性扩增⽐较。
种内变异还显⽰在ITS⽚段⼤⼩上，ITS区在核糖体RNA中进化较快，可在同⼀属间甚⾄群体间发⽣变化。
其中ITSII区在种间变异性较⾼（22%），种内变异性较低<3%）。
Tedersoo[2]总结了⽂献中提供的可供选择的ITS引物，但这些引物并不是尽善尽美，有些引物对真核⽣物专⼀，可能导致扩增出许多⾮真菌的序列，影响测序的序列数量。
有些对真菌专⼀，⼜可能导致⼀些重要类群的丢失。
兔皮肤病原真菌的分离及其ITS序列的分析鉴定
Is ola tion of R abbit Derma tophyte s a nd Ana lys is a nd Ide ntifica tion of The irITS Se quence sLI Ming-yong ，M U Te ，LIU Ma n ，WANG Zha o-Pe ng（Qingdao Kangda Foo d Co mp a ny L imited ，Qingda o 266400）Abstr act:[Objectiv e]Rabbit Dermatophytes were isolated and their ITS sequences were analy zed and identified.[M ethod]T he co llected scurf and scab were cultured ，and then identified by morpho log ical traits;the fung al ITS region-specific primers were used to perform amplification and sequencing of the ITS.Thro ug h the blast analysis betw een ITS sequences and GenBank nucleic acid database ，the bio logical classificatio ns were identified and finally their relationships w ere analyzed acco rding to the phylo genetic tree.[Result]T he isolated rabbit Dermato phy tes were preliminary identified as M icrosporum by morpho log ical characteristics;the results of sequence analysis and phylogenetic tree show ed that the isolated fungi and M icro spo rum gypseum strain WCH-M G001（Accession Number:GU348990.1）belo nged to one g roup w ith 99%ho molo gy ，indicating that the isolated f ungi w ere M icrosporum g ypseum.Key words:Rabbit;Dermato phyte;M icrosporum gy pseum;ITSsequence 兔皮肤病原真菌的分离及其ITS 序列的分析鉴定李明勇，牟特，刘曼，王召朋（青岛康大食品有限公司，青岛266400）摘要:【目的】分离发病兔场皮肤真菌病的病原，并对其ITS 序列进行分析鉴定。
(重点)猕猴桃果实贮藏期主要真菌病害的rDNA_ITS鉴定及序列分析_段爱莉
中国农业科学 2013,46(4):810-818 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.04.015收稿日期：2012-02-07；接受日期：2012-12-14基金项目：陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项（2009ZDKG-05）、陕西省科技统筹创新工程计划项目（2012KTJD03-05）、猕猴桃质量安全技术研究与示范（771845）、西安市科技项目：果树等品种选育、快繁、贮藏及病虫害防治技术研究与应用--猕猴桃贮藏期灰霉病、青霉病防治关键技术研究(NC1116（2）)联系方式：段爱莉，E-mail ：duanal009@ 。
通信作者高贵田，E-mail ：gaoguitian2006@猕猴桃果实贮藏期主要真菌病害的rDNA-ITS 鉴定及序列分析段爱莉1,3，雷玉山2，孙翔宇1，高贵田1，赵金梅1，谷留杰1(1陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710062；2陕西省农村科技开发中心，西安 710054；3甘肃省武威市工业企业人才服务中心，甘肃武威 733000）摘要：【目的】对陕西省周至县猕猴桃主栽品种‘华优’、‘海沃德’及‘秦美’贮藏期霉烂果实中的病原菌进行分离与鉴定，分析比较病原菌rDNA-ITS 序列的差异和种内与种间群体分化状况，确定优势菌，为病害防治提供依据。
【方法】采用病原菌形态鉴定与rDNA-ITS 鉴定相结合的方法，确定引起猕猴桃霉烂的病原菌种类；通过构建系统发育树，分析病原菌种之间的亲缘关系。
【结果】从贮藏期霉烂的猕猴桃果实中共分离出30株病原菌，主要为青霉属（Penicillium ）、木霉属（Trichoderma ）、交链孢霉属(Alternaria ) 、毛霉属（Mucor ）、拟青霉属(Simplicillium )等5个属。
其中青霉属（Penicillium ）19株占63.3%，为优势菌，包括Penicillium sp . 、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum、Penicillium purpurogenum 和Penicillium commune ；木霉属（Trichoderma ）8株占26.7%较次之，包括Trichoderma longibrachiatum 和Trichoderma sp；交链孢霉属(Alternaria ) 、毛霉属（Mucor ）、拟青霉属(Simplicillium )各1株，各占3.3%；聚类分析表明，30株病原聚为五大类群。
白僵菌菌株的ITS序列鉴定
Science &Technology Vision 科技视界白僵菌属Beauveria Vuill.是全球分布的最常见的土壤虫生真菌[1],包含有球孢白僵菌B.bassiana (Bals.-Criv.)Vuill.和布氏白僵菌B.brongniartii (Sacc.)Petch 这两种具有重要经济价值的种类。
前者是森林生态系统中最为常见的一种昆虫病原真菌,属世界性分布物种,是害虫虫口自然调节的重要因子和以菌治虫的重要生物防治材料[2]。
因其具有致病性强、寄主范围广、对动物植物无害、不污染环境及易培养的优点,被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一[3]。
随着分子生物学技术的发展,相关技术也开始广泛被应用于昆虫病原真菌的分类和鉴定中。
ITS (内转录间隔区Internal Transcribed Spacer)ITS 区域序列的测定是目前真菌分类研究的一项重要技术手段,对于鉴定白僵菌及研究真菌属内和属间遗传关系具有重要作用[4-8]。
ITS 区指的是5.8S rDNA、18S rDNA 和28S rDNA 之间的转录间隔区,因其进化相对迅速而具多态性与保守性,对此序列的检测有助于分析菌株的遗传关系适合较低水平的系统学研究,真菌的ITS 序列长度一般在550-750bp(碱基对)。
ITS 序列主要被用于对不同生物型、菌株、种、属的分类鉴定,也可用于研究近或低级分类阶元的系统发育。
本文以研究室保存的8株白僵菌菌株为研究材料,通过对其ITS 序列的鉴定,明确菌株的遗传背景,找出不同菌株间的遗传差异,为进一步的研究提供准确可靠的研究材料。
1材料与方法1.1供试菌株随机选取8株于本实验室保存的球孢白僵菌菌株进行实验。
其编号分别为Bb01-Bb08。
1.2培养基液体SDY 培养基:蛋白胨1.0%,酵母粉1.0%,葡萄糖4.0%,pH 值7.0;PDA 培养基:200g 土豆去皮沸水煮20min,取汁,葡萄糖2.0%,琼脂粉2.0%。
ITS序列分析在药品微生物检验中真菌鉴定与控制中的应用研究
I TS 序列分析在药品微生物检验中真菌鉴定与控制中的应用研究房蕊,蒋波,范一灵,鲍英,徐伟东第一作者 Te:l (021)38839900-26204;E-m ai:l ru if ang1@126.co m(上海市食品药品检验所,上海201203)摘要 目的:通过ITS 序列相似性分析、系统发育关系分析和形态分类方法对无菌检验样品检出的两株真菌F162(GU 724349)和F927(GU 724350)进行了种类鉴定,并与实验室的环境真菌407(GU 724347)、413(GU724348)进行同源性分析。
方法:对样品的DNA 进行扩增和测序,获得真菌I T S 基因序列,并与G enBank 中相应的序列进行比对分析。
结果:真菌F162(GU 724349)和F927(GU 724350)的I T S 基因序列与G enBank 中P enicilli um sp .的序列相似性均为100%,与实验室的环境真菌407(GU 724347)、413(GU724348)的I T S 基因序列相似性均分别为93 80%,93 80%,93 63%,93 63%。
以N J 法构建的系统发育树显示无菌抽验样品检出的两株真菌与本实验室环境真菌同源性低,两者位于不同亚组。
结论:根据I T S 序列相似性分析、系统发育关系分析和形态特征观察的结果,将无菌检出菌鉴定为P enicilli um sp .。
关键词:青霉菌属;序列分析;系统发育关系;鉴定中图分类号:R 917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2011)02-0302-04Application of I TS se quences i n identificati on andcontrol of fungi in phar m ace uticalm icrobi al testFANG Ru,i JI A NG Bo ,F AN Y i-ling ,BAO Y ing ,XU W e i-dong(Shanghai I n stitute f or Food and Drug Con tro,l Sh anghai 201203,Ch i na)Abst ract Objec tive :To i d entify t h e species of fung i F162(GU724349)and F927(GU724350)found i n phar m a ceuticalm icr obial test and analysis the i n ternal transcribed spacer (I TS)sequence si m ilarity bet w een the m w ith 407(GU724347)and 413(GU 724348)found i n the m icr obial laborator y .M et hod :The I T S sequence of the sa m ples w ere a mp lified and sequenced to analysis the si m ilarity w it h P enicillium sp .i n Genbank.R esults :The result o f sequence a nalysis showed that the si m ilarity o f I T S gene sequence is 100%bet w een F162(GU724349)and F927(GU724350)w ith Penicilli u m sp .i n Genbank ,and sequence si m ilarity of 93 80%,93 80%,93 63%and 93 63%w ith 407(GU724347)and 413(GU724348),respecti v e l y .The phylogenetic relationsh i p tree fr o m I TS gene sequence revealed t h e 407and 413w ere i n the different subgroup .Conclusion :The F162and F927were i d entifi e d as P enicillium sp .based on the m orpholog ical characteristics ,sequence analysis and phy l o genetic relationsh i p s .K ey w ords :P enicilliu m sp .;sequence analysis ;phy l o genetic re lationsh i p ;identification 在药品的无菌检测霉菌检测项目中,微生物实验室的环境洁净程度直接关系到检验结果的有效性和准确性。
菌种鉴定通用引物
菌种鉴定通用引物引言菌种鉴定是微生物学领域中的一项重要工作，它对于疾病诊断、环境监测和食品安全等方面具有重要意义。
菌种鉴定的关键是通过引物对目标微生物的DNA序列进行扩增和分析，从而确定其分类地位和种属鉴定。
本文将介绍菌种鉴定通用引物的原理和应用。
一、引物的选择原则菌种鉴定通用引物的选择需要考虑以下几个因素：1. 引物的特异性：引物应具有足够的特异性，只能扩增目标微生物的DNA序列，而不扩增其他非目标微生物的DNA序列。
2. 引物的保守性：引物应选择在目标微生物的DNA序列中高度保守的区域，以确保扩增的目标序列的一致性。
3. 引物的长度：引物的长度应适中，一般为18-30个碱基对，过长的引物可能导致扩增效率降低，而过短的引物可能导致特异性降低。
4. 引物的G+C含量：引物的G+C含量应适中，一般在40-60%之间，过低或过高的G+C含量可能影响扩增效率。
5. 引物的互补性：引物的两个端部应互补，以确保引物在目标DNA 序列上的结合和扩增。
二、常用的菌种鉴定通用引物1. 16S rRNA通用引物：16S rRNA序列是细菌和古菌中高度保守的基因序列，因此广泛用于细菌和古菌的鉴定。
常用的引物包括27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。
2. 18S rRNA通用引物：18S rRNA序列是真核生物中高度保守的基因序列，因此广泛用于真菌和原生动物的鉴定。
常用的引物包括ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。
3. 基因编码区通用引物：除了rRNA序列外，一些基因编码区的引物也被广泛应用于菌种鉴定。
例如，ITS区（内转录间隔区）是真菌常用的鉴定区域，常用的引物包括ITS1和ITS4。
核rDNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究中的应用
核rDNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究中的应用*王建波 张文驹 陈家宽摘要被子植物与其它高等真核生物相似, 核rDNA是高度重复的串联序列。
由于同步进化的力量,绝大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合。
核rDNA的内转录间隔区(ITS)包含被5.8S rDNA所分隔的ITS1和ITS2 两个片段, ITS1的长度为187～298 bp, ITS2为187～252 bp,经PCR扩增后可以方便地对这两个片段进行直接测序或克隆测序。
ITS序列变异较快,可以提供较丰富的变异位点和信息位点,已证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记,不仅可用于解决科、亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题,而且可用于重建多倍体复合体的网状进化关系,探讨异源多倍体的起源过程,然而,正是由于ITS序列变异较快，它一般不适于科以上水平的系统发育研究。
关键词ITS序列; 系统发育; 进化; 被子植物Application of ITS sequences of nuclear rDNA inphylogeneticand evolutionary studies of angiosperms1 WANG Jian-Bo2 ZHANG Wen-Ju 2 CHEN Jia-Kuan1 (College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072)2 (Institute of Biodiversity,Fudan University,Shanghai 200433)Abstract Nuclear rRNA genes (rDNA) in angiosperms are arranged in long tandem repeating units, much like those of other higher eukaryotes. Owing to rapid concerted evolution, the repeat units have homogenized or nearly so in most species. The internal transcribed spacer (ITS) of nuclear rDNA is composed of ITS1 and ITS2, which are seperated by 5.8S rDNA. The two spacers, ITS1 (187～298 bp) and ITS2 (187～252 bp), can be readily amplified by PCR and sequenced using universal primers. The sequences contain many variable sites and potential informative sites among related species, and have been proven to be a useful molecular marker in phylogenetic and evolutionary studies of many angiosperm taxa. It can be used not only in classification and phylogenetic inferences at the levels of family, subfamily, tribe, genus and section,but also in reconstruction of reticulate evolution and detection of the speciation via hybridization and polyploidization. But this region may not be useful for resolving phylogenetic relationships among families or taxa of higher hierarchy owing to the rapid variation of the ITS sequences.Key words ITS sequence; Phylogenetics; Evolution; Angiosperm现代分子生物学技术的迅速发展，为系统与进化植物学研究提供了丰富而翔实的资料，为解决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面的难题提供了极为有力的技术途径(汪小全，洪德元,1997; Soltis & Soltis,1993)。
真菌核糖体its检测实操
真菌核糖体its检测实操
真菌核糖体ITS检测是一种常用的真菌分类和鉴定方法，通过ITS（Internal Transcribed Spacer）区域的序列分析，可以确定真菌的种属信息。
下面是真菌核糖体ITS检测的一般操作步骤：
1. 样品处理：收集需要检测的真菌样品，可以是土壤、植物组织或是其他环境样品。
对于土壤样品，可以进行简单的干燥和粉碎处理，以便提取样品中的DNA。
2. DNA提取：使用合适的DNA提取试剂盒或方法，从样品中提取真菌的DNA。
可以根据厂家提供的操作手册进行操作。
3. PCR扩增：设计并合成适用于ITS区域的引物，使用PCR方法扩增样品中的ITS序列。
反应条件和引物浓度可以根据实验室的实际情况进行优化。
4. 凝胶电泳：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，以检测扩增的目标片段是否存在。
5. 测序：对扩增产物进行测序，可以选择发送给专业机构进行测序，也可以根据实验室情况选择自己进行。
6. 数据分析：使用生物信息学软件或在线工具，将测序获得的ITS序列与数据库中的参考序列进行比对，确定真菌的分类信息和种属归属。
以上是真菌核糖体ITS检测的一般操作流程，具体操作细节可以根据实验室的设备和实验要求进行调整和优化。
galactomyces种属its测序引物 -回复
galactomyces种属its测序引物-回复什么是Galactomyces种属？Galactomyces种属是真菌中的一类，属于酵母菌门（Saccharomycotina）中的一个属。
Galactomyces种属中包含了多种酵母菌，常见的有Galactomyces candidum和Galactomyces geotrichum等。
Galactomyces种属的特点Galactomyces种属的真菌具有以下特点：1. 球状细胞：Galactomyces种属的真菌通常为球状细胞，其大小约为3-7微米。
2. 白色菌落：这些真菌在培养基上形成光滑、白色的菌落。
3. 异丙醇耐受性：Galactomyces种属的真菌对异丙醇具有较高的耐受性，可以生长在含有异丙醇的培养基上。
4. 高产乳酸：一些Galactomyces种属的真菌可以产生较高浓度的乳酸。
5. 高产β-半乳糖苷酶：Galactomyces种属的真菌可以分泌β-半乳糖苷酶，这种酶可以降解乳糖和乳糖苷类物质。
Galactomyces种属的应用领域由于Galactomyces种属真菌的特殊特性，它们在多个领域具有广泛的应用前景。
1. 食品工业：Galactomyces种属的真菌常被用于食品加工中。
它们可以降低食品中的乳糖含量，降低乳糖不耐症患者的不适症状。
同时，Galactomyces种属的真菌还可以产酸、促进面团和面包的发酵。
2. 医药领域：Galactomyces种属的真菌对于医药工业也有着重要的价值。
它们可以产生一些有益的代谢产物，如抗生素、酶和有机酸等，这些物质对于药物开发和制造有着重要的应用价值。
3. 生物修复：Galactomyces种属的真菌对于生物修复也具有一定的作用。
它们可以分解有毒物质，为环境的恢复提供帮助。
4. 酿酒工业：一些Galactomyces种属的真菌被用于传统酿酒工艺中，帮助发酵，增加酿酒的口感和质量。
Galactomyces种属的ITS测序引物ITS（Internal Transcribed Spacer）是真菌的进化分析和物种鉴定中常用的DNA片段。
ITS序列分析在真菌分类中的应用
I T S序列分析在真菌分类鉴定中的应用陈剑山1,2,郑服丛1,2*(1.华南热带农业大学环境与植物保护学院,海南儋州571737;2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州571737)摘要综述了IT S序列分析技术的原理、特点及近年来在病原真菌分类鉴定上的应用,同时对IT S序列分析技术在真菌分类鉴定研究领域中的前景进行了展望。
关键词IT S;分类;鉴定中图分类号Q789文献标识码 A 文章编号0517-6611(2007)13-03785-02A pp lic a t ion o f I T S S e qu en c e s in F un g i C la ss ific a tio n an d Id e n t ific a tionCHEN J ia n-sh an e t a l(E n v ironm en t an d P lan t P ro tection C o llege,SCU T A,D an zh ou,H a i n an571737)A b s tra c t T h e pr in cip le,ch a racte r is tics an d th e app lica tion o f IT Ssequ en ce s infun g i class ifica tion an d iden tifica tion inrecen t ye ar s w ere sum m a rized.A nd its p rospe ct w a s pu t fo rw a rd.K e y w o rd s IT S;C la ssifica tion;Iden tifica tion真菌的分类鉴定是一项浩大的系统工程。
传统的真菌分类学主要按照真菌的形态学、生理生化特点、抗原构造等特征。
由于真菌的种类众多、个体多态性明显,因此传统的分类学指标常会得出假阳性或假阴性结果,给真菌的分类鉴定带来了一定的难度。
ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用
1 ITS 在真菌分类 、 鉴定方面的应用
自 White 等 1990 年首先设计 ITS 引物对真菌核内核糖体
RNA 基因进行扩增以来，ITS 序列分析技术在真菌分类 、 鉴定
的研究中应用越来越广泛 ［4］。 传统真菌的分类 、鉴定主要是基
收稿日期 ：2008－09－19 作 者 简 介 ： 白 树 猛 （1983 —）， 男 ， 硕 士 ， 主 要 研 究 方 向 为 海 洋 微 生物学 。
［1］
rDNA 在种 内 由 于 基 因 的 流 动 而经 常 表 现 出 很 高 的 同
源性 ， 在种间则保持着各种程度的变异 。 变异的多少能够反 映生物进化上属内种间亲缘关系的远近 。 最常见的变异是
GeneBank 中登录的炭疽属 24 个种的 ITS 序列进行比较 ，分别
建立 ITS1、ITS2 聚类分析图 ，探讨炭疽属的系统发育情况 。 陈 玉玺［7］等探索镰刀菌菌株间的系统发育关系 。 通过对分离到的 镰刀菌菌株进行 ITS 序列测定 ， 采用邻接法构建相关菌株的
2 ITS 在真菌分子检测中的应用
目前 ， 关于真菌分子检测的研究主要是针对致病真菌进 行的。 传统病原真菌的检测主要基于形态学特征 、致病性测定 等。 但是这种方法耗时长、程序繁琐，不宜从发病初期的植株中 分离鉴定病原菌，难以做到对病害的早期检测 。 随着生物学的 发展，很多生物技术应用于检测领域 ，如酶联免疫荧光技术。 但 是该方法利用多克隆抗体进行检测 ，特异性不强 ，实际应用中 存在漏检现象［22］。 近年来 ，利用 PCR 扩增病原真菌核糖体 ITS 基因片段进行病原菌检测得到了很大发展 。 由于核糖体基因
ITS 这一 全 新 的 分 子 标 记 技 术以 其 快 速 、 准 确 、 灵 敏 度
利用ITS序列鉴定真菌
利用ITS序列鉴定真菌摘要：采用蘑菇提取的DNA及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后进行分析照相，测序。
随着核糖体Rdna ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息的到阐明。
关键词：ITS序列酵母菌 PCR 菌种鉴定1 材料与方法1.1材料与试剂：真菌组织（蘑菇）、菌丝体或孢子、氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。
70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。
10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。
1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次，CTAB 溶液、异丙醇，双蒸水，3MNaAc，PH5.2 20ug/RNaseA，特异性片段PCR扩增，ITS引物（F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）。
1.2主要仪器与设备表一实验中使用的主要仪器仪器名称型号产地立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂数显HH-4 国华电器有限公司电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂制冰机AF200PSC50R ΜSA生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany电子精密天平HR-200 上海精科天平酸度计DELTA302 上海电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂台式常温高速离心机Centrifuge 5415D Germany恒温水浴锅多型号Germany生化培养箱LRH-250 上海一恒科技有限公司基因扩增仪Palm-Cyeler Aμstralia电泳槽DYCZ-24A 北京六一仪器厂1.3实验方法：真菌基因组DNA的提取（1）CTAB溶液在65℃水浴中预热（使用前加入1％巯基乙醇），取适量（2）取适量蘑菇置于研钵中，加入液氮，用小杵磨制粉状，研磨期间及时添加液氮防止高温氧化。
ITS序列分析法鉴定烟草病株分离出的两种真菌
1.1 材 料
烟株 烤烟品种云32，邵武地区种植，发病后送检。
孟加拉红培养基 北京奥康星生物技术有限责任公司 PDA培养基 北京奥康星生物技术有限责任公司 真菌基因组DNA快速抽提试剂盒 生工生物工程上海股份有限公司。改良马丁培养基配方1 L 蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸镁0.5 g， pH值 6.4，121 ℃灭菌20 min。
PCR反应体系为50 L DNA模板2 L 10缓冲液5 L d NTP每种2.5 mmolL12 L 引物10 molL1各2 L Taq DNA 聚合酶5 UL10.4 L 无菌水补足至50 L。PCR反应程序为 95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 L PCR产物加1 L 6溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上110 V电泳35 min，凝胶成像仪拍照。
1.2.4 ITS序列分析 测序交由生工生物工程上海股份有限公司进行，对所得序列进行BLAST分析[6]，采用Maximum LikelihoodML法构建系统发育树，Bootstrap 重复500 次检验各分支的置信度，最终确定菌株的分类地位。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离纯化
烟草作为一种重要的经济作物，在我国的种植面积和产量均居世界前列，但每年烟草病害的发生比较严重，给烟农和国家经济带来巨大损失。我国烟草种植区域广，病害种类、分布和危害情况因不同地域而有很大差异，全国 16个主产烟省区烟草侵染性病害有62种，其中真菌性病害30种[1]。福建省是我国烟草主产区，烟草侵染性病害发生种类有31种[2]，主要为烟草炭疽病、烟草赤星病、烟草黑胫病、烟草青枯病、烟草病毒病等5类[3]，在31种烟草侵染性病害中真菌性病害有10种，且新的侵染性病害不断出现，如米根霉引起的烟叶霉烂病等[4]。
两株灰黄霉素产生菌的18S rDNA和ITS序列测定与分析
两株灰黄霉素产生菌的18S rDNA和ITS序列测定与分析陆娇娇; 畅瑛; 李波; 施碧红【期刊名称】《《福建农业科技》》【年(卷),期】2019(000)010【总页数】6页(P10-15)【关键词】灰黄青霉; ITS序列; 18SrDNA; 系统发育树【作者】陆娇娇; 畅瑛; 李波; 施碧红【作者单位】福建师范大学生命科学学院福建福州 350117【正文语种】中文【中图分类】Q754灰黄霉素是一种有效的聚酮类抗真菌抗生素，可用于治疗皮肤癣菌引起的浅层真菌感染，在农业上也用于防治多种植物病原菌，灰黄霉素还能在体外抑制肝炎病毒的复制[1-2]。
近年来发现灰黄霉素可抑制癌细胞中心体聚集，从而形成多级纺锤体，导致癌细胞分裂抑制而死亡[3]。
鉴于灰黄霉素的医用和农用价值，人们对灰黄霉素高产菌株的选育工作一直持续进行。
本研究采用的D-756是吴松刚等[1]用野生菌展青霉Penicillium patulum 4541经13轮复合诱变获得的灰黄霉素高产突变株。
突变株D-756与出发野生菌株4541相比，孢子形态由野生菌的绿色变为白色，灰黄霉素的合成能力也大幅提高[4-5]。
但目前就两者的遗传背景差异知之甚少，明确诱变系谱中菌株的系统发生关系是进行后续遗传研究的基础。
传统的真菌分类主要以形态学观察结合生理生化特征分析为主，但真菌的种类繁多复杂，种属间的形态学差异不明显，生理生化性状也会发生交叉重叠，且容易因温度、湿度、土壤等生活环境的改变而变得不稳定，因此传统的方法进行种属间鉴定时有出现同名异物或异物同名的情况[6]。
随着真菌分类学的发展，一些影响较大或在早期的文献中普遍的种名，因种的概念的变化，现已成为其他种的异名，如展青霉Penicillium patulum、荨麻青霉Penicillium urticae现均是灰黄青霉Penicillium griseofulvum Dierckx的异名[6]。
在关于灰黄霉素早期的研究报道中，有不少来自展青霉或荨麻青霉的报道，包括本研究的菌株D-756和4541也存有这种情况[1,4-5]。