流式基本知识

一步一步学流式第一篇：流式细胞术的历史概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。

FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。

1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。

1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。

于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。

这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。

其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。

1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。

1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。

这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。

现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。

1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。

（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。

换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。

流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。

他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。

Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。

FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。

（下图为一DNA直方图）DNA直方图第二篇：流式细胞仪的工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。

用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。

经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。

前向角散射，即FSC与细胞直径平分正相关，所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。

侧向角散射，即SSC是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息！因此，仅根据FSC/SSC，我们就可以分开全血样本中的淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞！这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。

光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

（下图为光学系统）检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。

单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。

一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。

对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图(histogram)，也可以选择二维的散点图(dot plot)、等高线图(contour)或三维立体视图(pseudo 3D散点图及三维立体图细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。

在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。

将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

也就是高中学过的带电粒子在电场中运动的原理！补充细节1：关于荧光素荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。

自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。

在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。

一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

当应用流式细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时，除必要的抗体外，应用各种荧光素也是必不可少的，它包括单标记抗体荧光索、双标记抗体荧光素、三标记抗体荧光素等。

荧光素发射荧光基本原理是：荧光素受到一定波长(激发波长)的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长(发射波长)的荧光。

不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发，所以要选择正确的激光器。

例如，FITC和FE等的微发光波长均为488nm，所以可用产生可见光的氩离子激光器，而APC和PC5等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm波长红光的氦—氖激光器。

此外，各种荧光素的发射波长也十分重要，可以据此确定其检测所需光电倍增管性质。

如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管(即PMTl)；PE则发射橙包光，需用第二光电倍增管(即PMT2)；PC5和PcrCP等发射的是深红色光，这时需选择第二甚至第四光电倍增管(即PMT3或PMT4)等。

一定要注意激发波长和发射波长的区别！常用荧光素流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。

488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。

他们的激发光和发射光波长分别是：激发光波长（ηm）发射光峰值（ηm）FITC 488 525（绿）PE 488 575（橙红）PI 488 630（橙红）ECD 488 610（红）CY5 488 675（深红）PreCP 488 675（深红）FITC和PIPI和EB 都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并有与碱基对结合的特异性。

为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。

PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此又可以用于检测死细肥。

PI 和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在作DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。

另外，Pl比EB测得的DNA分布的变异系数(CV值)低，所以PI得到更广泛的应用。

FITC 为一种小分子荧光素，其效率(即荧光强度)取决于溶液的pH值，因此在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。

一些流式常用名字的概念和意义：（E文版）Amplifier 放大器Electronic component of a flow cytometer that increases the signal by an adjustable factor.Aneuploid 异倍体Having an abnormal number of chromosomes. Aneuploid cells may also have an abnormal DNA content.Average The mean value, which is the total amount divided by the number of contributors.Channel 常说的荧光道数The measured value of a parameter, representing the signal intensity of an event after amplification. To appear on a plot, data for an event must fall into one of either 256 channels (0-255) or one of 1024 channels (0-1023) depending on the resolution of the plot.Compensation （荧光）补偿An electronic calculation that removes signal overlap which the optical system cannot remove. Fluorescence compensation works for specific pairs of fluorescent parameters; for example, FL1 and FL2.Cursor For FACScans: a highlight appearing in a data field that indicates you can modify this field. On a dot plot, a crosshair for drawing a polygon gate. On other flow cytometers: a line separating regions on single parameter histograms that are treated statistically separate. See marker.%CV CV值！表示其集中分散趋势。