免疫共沉淀Immunoprecipitation
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。
免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。
其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。
与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。
不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。
在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。
二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。
但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。
（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。
但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。
三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。
若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。
（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。
免疫共沉淀详细操作方法
免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP是利用特异性抗体从样品中特异性“捕捉”目的蛋白/片段的技术，其首要条件是将特异性抗体作固相化固定，目前常Frdbio用的思路是利用Protein A/G的琼脂糖凝胶，通过与抗体的Fc段特异性结合，间接固定特异性抗体；特异性抗体固定以后。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，就可以特异性抓取目的蛋白/抗原/片段，与亲和层析纯化的原理完全相同，实验过程：利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原/蛋白/片段。
实验步骤：样品前处理：以细胞为例1、蛋白量的估算：一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)；实验者根据自己实验用量自己选择；福因德科技2、细胞的裂解：（溶液配制见附录，配制溶液需要加蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
）1）冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4）洗1遍，加入细胞裂解液200ul/孔（3×106细胞），冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中；2）超声：强度45％，5秒×10次。
（如果效果不好需要适当调整超声波的强度）3）离心细胞裂解液：4℃10000rpm 10 分钟，取上清。
3、Agrose-proteinA/G清洗：取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul 1×PBS（4℃）清洗（1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G），5000rpm×2分钟，吸掉上清，如此重复清洗3次以上。
4、细胞裂解液预清洗：Friendbio将步骤2裂解的细胞与步骤3清洗好的Agrose-proteinA/G 4℃摇床孵育1个小时，5000rpm×2分钟，取上清备用。
免疫共沉淀
1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：A.蛋白样品的准备：A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。
对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。
如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
B.去除非特异性结合(可选做)：B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。
通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
C.免疫沉淀：C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。
(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。
免疫共沉淀质谱
免疫共沉淀质谱免疫共沉淀质谱（immunoprecipitation-massspectrometry，简称IP-MS）是一种常用的蛋白质相互作用分析技术。
该技术结合了免疫沉淀和质谱分析，能够鉴定蛋白质相互作用和识别蛋白质复合物的成员，广泛应用于生命科学、疾病诊断和治疗等领域。
一、IP-MS 的基本原理IP-MS 技术的基本原理是利用特异性抗体将目标蛋白质从混合物中沉淀下来，然后用质谱分析鉴定沉淀物中的蛋白质。
该技术主要包括以下步骤：1. 样品制备：将需要分析的生物样品（如细胞、组织、血清等）进行处理，如细胞裂解、组织切片等，得到蛋白质混合物。
2. 免疫沉淀：将特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原抗体复合物。
然后将混合物与抗原抗体复合物一起孵育，使复合物形成。
接着用亲和树脂或磁珠等材料将复合物捕获下来，得到免疫沉淀物。
3. 洗涤：用缓冲液对免疫沉淀物进行多次洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4. 质谱分析：将免疫沉淀物用电泳或染色分析等方法进行分离，然后用质谱分析仪器对分离后的蛋白质进行鉴定和定量。
二、IP-MS 的应用1. 鉴定蛋白质相互作用：利用 IP-MS 技术可以鉴定蛋白质相互作用，例如鉴定蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质、蛋白质与小分子等的相互作用。
这些相互作用对于细胞信号转导、代谢途径、基因表达等生命过程起着重要作用。
2. 识别蛋白质复合物的成员：许多生物过程涉及到蛋白质复合物的形成，如核糖体、酶复合物等。
利用 IP-MS 技术可以识别蛋白质复合物的成员，进而揭示其功能和调控机制。
3. 疾病诊断和治疗：许多疾病的发生和发展都与蛋白质相互作用和复合物形成有关。
利用 IP-MS 技术可以鉴定疾病相关的蛋白质相互作用和复合物，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
三、IP-MS 的优缺点IP-MS 技术具有以下优点：1. 特异性高：利用特异性抗体进行免疫沉淀，可以选择性地捕获目标蛋白质。
免疫共沉淀(Immunoprecipitation,+IP)
局限性:
需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛 选未知蛋白会遇到障碍。 免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合 物为直接相互作用的两种蛋白。 用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合 适，与Western blotting或者ELISA相比容易出 现假阳性反应。 灵敏度不如亲和色谱高。 不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结 构的蛋白质一蛋白质相互作用。
实验流程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适 量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶 抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4°C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析， 剩余裂解液加1μ g相应的抗体加入到细胞裂解 液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μ l protein A 琼脂糖珠，用适量 裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μ l protein A 琼脂糖 珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底； 将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液 洗3－4次；最后加入15μ l的2×SDS 上样缓冲 液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 仪分析。
乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别
异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候 一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一 些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游 的实验影响小 。 异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是 去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 有 时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。 在 沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇， 所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时， 用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温 下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。 异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶 液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影 响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
免疫共沉淀裂解液
免疫共沉淀裂解液介绍免疫共沉淀裂解液（immunoprecipitation lysate）是生物学领域常用的一种实验技术。
通过利用抗体的特异结合性，将目标蛋白与周围环境中的其他蛋白分离开来，从而研究蛋白相互作用、信号传导等生物过程。
本文将深入探讨免疫共沉淀裂解液的原理、方法以及其在科研中的应用。
原理免疫共沉淀裂解液的原理基于抗体的选择性结合性。
在免疫共沉淀实验中，首先需要制备兔抗体或小鼠抗体，并与抗原进行免疫反应。
抗体与抗原的结合形成特异性复合物，可用于将目标蛋白与周围环境中的其他蛋白区分开来。
方法1.细胞裂解–收集细胞或组织样品，并迅速冰冻保存以阻止蛋白质的降解。
–加入裂解液（含有蛋白酶抑制剂）并彻底悬浮细胞或组织。
–放入低温培养箱中离心，收集上清液（裂解液）。
2.抗体结合–将收集的裂解液与特异性抗体一起孵育，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。
–可根据实验需求是否添加交联剂，如二甲亚砜（DMS）、氯化亚铊（Thio）、二甲亚砜和Thio的混合物等，增强免疫复合物的稳定性。
3.共沉淀及洗涤–添加蛋白A/G琼脂糖或其他蛋白A/G亲和柱材料，促使免疫复合物与之结合。
–将样品加入柱材料中，并反复冲洗以去除非特异性结合的蛋白和其他杂质。
–收集洗涤液中的目标蛋白，可用于进一步的分析和检测。
4.目标蛋白的检测–使用SDS-PAGE分离复合物中的蛋白。
–将蛋白转移到膜上，并进行免疫印迹（Western blotting）或质谱分析等技术，检测目标蛋白。
应用免疫共沉淀裂解液在生物学研究中应用广泛，主要用于以下领域：1.蛋白相互作用研究–免疫共沉淀可以用于鉴定和验证蛋白－蛋白相互作用。
通过将抗体与目标蛋白结合，可以共沉淀与其相互作用的蛋白，进一步阐明细胞中各个蛋白之间的相互关系。
2.信号转导研究–免疫共沉淀可以用于研究信号转导通路中的蛋白质复合物。
通过免疫共沉淀，可以分离出参与信号转导的关键蛋白，进一步了解其在信号传导过程中的功能和调控机制。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
COIP免疫共沉淀实验原理
COIP免疫共沉淀实验原理COIP（Co-immunoprecipitation）又称为共沉淀法，是一种常用的蛋白质相互作用研究方法。
该方法通过特异性抗体结合可以与靶蛋白相互作用的蛋白进行共沉淀，进而检测目标蛋白与其相互作用蛋白的存在。
COIP 方法可以用于研究蛋白质相互作用的结构、功能和动力学等方面。
COIP方法的原理可以总结为以下几个步骤：1.细胞裂解：首先需要获取含有目标蛋白的样品，可以是细胞裂解液或组织提取物。
样品需要经过适当的处理，最常用的是利用磷酸缓冲液含有盐洗涤细胞，从而打破细胞膜，使蛋白质裂解。
2.共沉淀试剂的制备：共沉淀试剂通常由特异性抗体与载体蛋白（如蛋白A/G或青霉素酰胺等）结合而成。
特异性抗体用于识别目标蛋白，载体蛋白则用于固定和沉淀抗体-抗原复合物。
载体蛋白通常具有亲和力，能够与抗体结合形成稳定的复合物。
3.共沉淀试剂的结合：将共沉淀试剂加入细胞裂解液中，使其与目标蛋白结合形成复合物。
目标蛋白与抗体结合后，与载体蛋白的特异性结合使复合物能够稳定。
4.免疫共沉淀：此步骤是COIP方法的核心，其目的是将目标蛋白及其相关蛋白质结合的复合物从细胞裂解液中沉淀下来。
常用的方法有加入蛋白A/G琼脂糖磁珠或微珠，使其与抗体-抗原复合物相互结合形成稳定的复合物，然后通过磁力或离心沉淀下来。
此步骤通常需要进行数次洗涤以去除非特异性结合的蛋白质。
5. 分离和分析：最后将COIP得到的蛋白复合物溶解或电泳分离，然后通过Western blot等方法检测目标蛋白及其相互作用的蛋白质。
总的来说，COIP（共沉淀法）通过特异性抗体和载体蛋白的结合形成稳定的复合物，实现了目标蛋白及其相互作用蛋白的共沉淀。
通过COIP 方法可以探究蛋白质相互作用的结构、功能和动力学等方面的研究。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫共沉淀联合质谱
免疫共沉淀联合质谱
免疫共沉淀联合质谱（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）是一种新型的蛋白质互作分析方法，它将免疫共沉淀（IP）和质谱技术（MS）相结合，可以有效地确定蛋白质间的互作关系，为研究蛋白质组学提供重要帮助。
IP-MS技术包括三个主要步骤：1）特异性免疫共沉淀；2）共沉淀物的鉴定；3）蛋白质互作网络的建立。
1、特异性免疫共沉淀
免疫共沉淀是一种用于研究蛋白质之间相互作用的常用技术，它能够特异性地捕获细胞内的蛋白质或多肽结合到表位抗原的抗体上。
这一步需要选择有特异性的抗体，并将抗体与细胞内的抗原结合，使其能够特异性地结合到细胞内的蛋白质或多肽上。
2、共沉淀物的鉴定
一般情况下，IP技术能够捕获蛋白质，但无法鉴定出捕获的蛋白质是什么，因此需要进一步将共沉淀物分离，并用质谱技术对共沉淀物进行分析，以确定其组成成分。
质谱技术可以高精度地测定蛋白质的分子量，并利用蛋白质数据库来鉴定出所捕获的蛋白质是什么。
3、蛋白质互作网络的建立
根据共沉淀物的鉴定结果，可以建立蛋白质互作网络，从而可以更好地理解蛋白质之间的互作关系，以及蛋白质组学中的生物学调控网络。
IP-MS技术具有高灵敏度、高特异性和快速分析的优势，在研究蛋白质组学方面有着重要的应用价值。
它不仅可以用于鉴定蛋白质相互作用，还可以用于研究蛋白质的结构和功能，从而为生物学研究提供重要的参考。
免疫沉淀IP
免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫共沉淀
起桥梁作用；
如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，
以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，
实验本身具有冒险性。
1.
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力
也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明 书。特别是多抗的特异性是问题。
INMAP 是一个在 有丝分裂中起重 要作用的蛋白， 保证了纺锤体和 端粒的完整性。 本 文 研 究 了 INMAP 通 过 P53/P21 途 径 起 作用。
结论？
一. 二. 三.
免疫沉淀（IP） 免疫共沉淀（CO-IP） 免疫共沉淀结果分析
免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗 体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗 体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白） 从混合体系沉淀下来。
免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗原蛋 白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein
Western blotting 或质谱分析，即样品处理（温度，裂解液成 分）；抗体-agarose beads孵育（选择合适的阴性对照）；抗体 -agarose beads复合物洗涤；鉴定
非变性条件下进行实验；
需要高质量的抗体；
免疫沉淀体系需要有严格的控制指标
基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相 关实验手段：
定蛋白质的新的作用搭档。
（1） 蛋白样品准备：如果为细胞样品，需先裂解细胞；
（2） 抗原抗体结合反应； （3） Protein A/G 与抗原抗体复合物结合； （4） 免疫复合物与 protein A/G 解离： 一般采用 2% SDS 煮沸 5 分钟处理样品；
免疫共沉淀用的对照igg抗体
免疫共沉淀用的对照igg抗体免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的实验技术，用于直接检测蛋白质间相互作用或特定蛋白质与其他分子的结合。
在进行免疫共沉淀实验时，通常需要使用对照IgG抗体。
对照IgG抗体是与目标抗体相对应的无特异性抗体，用于评估免疫共沉淀实验的特异性和背景噪音。
为什么需要对照IgG抗体？免疫共沉淀实验主要通过抗体与目标抗原的特异性结合来检测和分析特定蛋白质间的相互作用。
然而，有时目标抗体可能会非特异地结合到非目标蛋白质上或结合到实验中的其他成分上，导致误判结果。
为了排除这种背景干扰，需要引入对照IgG抗体。
对照IgG抗体的选择在选择对照IgG抗体时，应确保其来源与目标抗体一致，以避免由于物种差异而引起的非特异性背景信号。
对于小鼠单克隆抗体，通常使用小鼠IgG总蛋白或与目标抗体同源的小鼠IgG抗体作为对照。
对于兔子单克隆抗体，可以使用正常兔子IgG总蛋白作为对照。
对于鼠和兔混合体系的实验，可以选择与目标抗原无关的不同物种来源的IgG抗体作为对照。
对照IgG抗体的应用对照IgG抗体主要用于验证免疫共沉淀实验中的特异性沉淀结果。
一般来说，实验中的样品分为两组，一组使用目标抗体进行沉淀，另一组使用对照IgG抗体进行沉淀。
通过对比两组实验结果，可以判断目标抗体的特异性。
如果只有目标蛋白质在目标抗体组中被沉淀，而在对照IgG抗体组中未被沉淀，说明目标抗体的沉淀是特异的。
相反，如果在对照IgG抗体组中也观察到目标蛋白的沉淀，那么可以判定目标抗体的特异性较差，实验结果需要谨慎解读。
另外，对照IgG抗体还可以用于控制背景信号的定量。
对照IgG抗体通常与目标抗体一样进行免疫共沉淀实验，但在目标抗体与样品混合前，先与其相应的蛋白G/A磁珠结合。
通过比较对照IgG抗体的沉淀量和目标抗体的沉淀量，可以评估背景信号对实验结果的影响。
总结在免疫共沉淀实验中，对照IgG抗体起着重要的作用。
免疫共沉淀质谱
免疫共沉淀质谱免疫共沉淀质谱（immunoprecipitation-massspectrometry，IP-MS）是一种广泛应用于生物学研究的方法，用于鉴定蛋白质相互作用的伴侣。
该方法结合了免疫沉淀和质谱分析技术，可以从复杂的混合物中鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣，从而揭示蛋白质相互作用网络的组成和功能。
本文将介绍IP-MS的原理、步骤和应用，并讨论该技术的优缺点以及未来的发展方向。
一、原理IP-MS的原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，将其与其相互作用伴侣共同沉淀下来，再用质谱技术检测沉淀物中的蛋白质成分。
该方法的关键在于选择合适的抗体，以确保沉淀物中仅含有目标蛋白质及其相互作用伴侣。
通常，IP-MS分为两种类型：单一免疫共沉淀（single IP-MS）和串联免疫共沉淀（tandem IP-MS）。
单一免疫共沉淀是指将抗体与目标蛋白质结合后，直接进行质谱分析。
而串联免疫共沉淀则是在单一免疫共沉淀的基础上，将沉淀物再次进行免疫沉淀和质谱分析，以筛选出更加特异的相互作用伴侣。
二、步骤IP-MS的实验步骤如下：1. 选择合适的抗体：选择与目标蛋白质结合的特异性抗体，并进行验证。
2. 免疫沉淀：将抗体与混合物中的目标蛋白质结合，然后添加磁珠或琼脂糖等固相材料，使其与目标蛋白质及其相互作用伴侣结合并沉淀下来。
3. 洗涤：用缓冲液洗涤沉淀物，以去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4. 质谱分析：将沉淀物进行蛋白质分离和消化，并用质谱技术进行分析和鉴定。
5. 数据分析：使用生物信息学工具对质谱分析结果进行分析和解释，以确定目标蛋白质的相互作用伴侣。
三、应用IP-MS已被广泛应用于生物学研究中，尤其是在蛋白质相互作用网络的研究中。
以下是IP-MS的一些应用领域：1. 鉴定蛋白质相互作用伴侣：通过IP-MS可以鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣，从而揭示蛋白质相互作用网络的组成和功能。
2. 研究蛋白质修饰：通过IP-MS可以鉴定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化和乙酰化等。
免疫共沉淀(Co-IP)
分离胶 将不同大小的蛋白分离开来
SDS-PAGE
胶板选择
根据样品数 和上样量数选择 适合尺寸的胶板 和相应的样品梳。
小型垂直电泳系统 14
胶浓度选择
根据待检测样品的分子量，选择合适浓度分离胶， 具体配置查阅分子克隆。
分离胶 H2O 30%丙烯酰胺 1.5MTris (pH8.8)
14聚 子阴0m%l合筛离（1后效子0 m形应去L）成。污交剂浓H叉，2缩O 网胶作状为结变构性，剂42m.使7和lml其助产溶生试分剂， 3断.3 m裂l 分子内和3分0%丙子烯间酰胺氢键，0.6去7 m折l 叠，消 2除.5 m电l 荷和分子1结M T构ris (的pH6影.8) 响。0.5 ml
淀实验，环状沉淀实验和凝胶内沉淀实验。
3
免疫共沉淀CoIP：
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是 确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作 用的有效方法。
CoIP原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内 存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了 下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
•电泳条件： 70V恒压30 min； 120V恒压1-1.5 h（具体时间根据分子量大
小，及预染Marker指示位置）。
转膜准备工作（湿转法）
•转膜缓冲液配置（预冷） 1 L体系：12.1 g Tris base 14.4 g Glycine 5%-20%甲醇
• 醋酸纤维膜： 略比胶大，根据蛋白质分子量可以选择不同 规格的，0.22μm；0.45 μm
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免疫沉淀 Immunoprecipi tion IP 原理
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min， 12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
免疫共沉淀中的缩写
疫共沉淀中的缩写
在免疫共沉淀（Immunoprecipitation）中，常用的缩写包括：
1. IP：Immunoprecipitation，免疫共沉淀。
2. Co-IP：Co-Immunoprecipitation，共同免疫共沉淀。
3. ChIP：Chromatin Immunoprecipitation，染色质免疫共沉淀。
4. RIP：RNA Immunoprecipitation，RNA免疫共沉淀。
5. AP：Affinity Purification，亲和纯化，有时也用于指代免疫共沉淀。
6. IHC：Immunohistochemistry，免疫组织化学检测，不是免疫共沉淀的缩写，但在相关领域中也常用到。
7. WB：Western Blotting，免疫印迹法，虽然不是免疫共沉淀的缩写，但在免疫共沉淀实验后常用于分析免疫共沉淀的结果。
这些缩写在研究生物学和免疫学领域中被广泛使用，用于描述不同类型的免疫共沉淀实验及相关技术。
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免疫共沉淀input组
免疫共沉淀input组
免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种用于鉴定蛋白质复合物的实验技术。
在免疫共沉淀实验中，首先需要制备特定抗体，并使用该抗体将目标蛋白质捕获。
然后，利用磁珠或珠子等固相载体捕获被抗体结合的蛋白质和与之结合的蛋白质复合物。
最后通过洗涤和_elute_操作来分离并纯化目标蛋白质和复合物。
通常，在进行免疫共沉淀实验前会设计一个input组，以检测非特异性沉淀和特异性沉淀。
input组是在IP实验中与目标样品相同的组织或细胞提取物，但不添加任何抗体。
通过将input组与实验组进行比较，可以确定免疫共沉淀实验中发现的复合物是否特异性结合到目标蛋白质，并评估实验的灵敏度和特异性。
需要注意的是，在进行免疫共沉淀实验时，input组应该与实验组在处理、存储等方面保持一致，以最大程度上消除非特异性因素的干扰。
免疫共沉淀中input作用
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与其他分子之间的相互作用。
在免疫共沉淀实验中，我们通常有两个主要组分：待测蛋白（target protein）和抗体（antibody）。
在实验中，待测蛋白是我们感兴趣的蛋白质，而抗体是一种专门识别和结合待测蛋白的分子。
免疫共沉淀实验的目标是使用特定的抗体选择性地沉淀待测蛋白，并在沉淀物中检测其与其他蛋白质或分子的相互作用。
输入（input）在免疫共沉淀实验中是一个关键的对照样品，通常是与待测蛋白没有直接相互作用的蛋白质或其他分子。
输入的作用是帮助确定实验结果中的非特异性结合或背景信号。
通过引入输入对照，我们可以区分特异性相互作用和非特异性结合。
当我们将输入样品与抗体一起加入到实验体系中时，我们期望抗体能够选择性地沉淀目标蛋白，并且与输入没有相互作用。
因此，在共沉淀物中观察到的信号应该主要来自于待测蛋白与抗体的特异性结合，而与输入无关。
输入通常是通过使用无关的抗体或与待测蛋白没有交互作用的蛋白质来实现的。
它可以帮助确定实验中的背景信号或非特异性结合，并确保我们正确地解释共沉淀实验结果。
通过与输入进行比较，我们可
以验证共沉淀物中的信号是否真正由待测蛋白与其他分子的特异性相互作用所引起。
因此，输入的作用是提供一个参考标准，用于区分特异性信号和非特异性结合或背景信号，从而帮助研究人员解释免疫共沉淀实验结果，并准确地确定待测蛋白与其他蛋白质或分子的相互作用。
这样的对照样品在免疫共沉淀实验中是至关重要的，以确保结果的可靠性和准确性。
免疫共沉淀 转录因子
免疫共沉淀转录因子免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种重要的实验技术，广泛应用于转录因子研究领域。
它可以帮助科研人员准确、高效地研究转录因子的功能和调控机制。
本文将简要介绍免疫共沉淀的原理和步骤，并讨论其在转录因子研究中的应用，希望能为读者提供一些实验设计和数据分析的指导意义。
免疫共沉淀是一种利用特异性抗体结合目标分子的方法，以识别和分离该分子及其相互作用伴侣。
在转录因子研究中，我们通常需要了解转录因子与其他蛋白质的相互作用，以及这些相互作用对基因调控的影响。
免疫共沉淀正是提供了一种直接获取这一信息的方法。
在进行免疫共沉淀之前，我们首先需要制备特异性抗体。
这通常需要经过免疫动物、纯化抗体等步骤，并确保抗体的特异性和效能。
接下来，我们需要准备细胞或组织提取物，并进行细胞裂解以释放目标蛋白质。
裂解后的提取物中包含了大量的蛋白质，而我们希望专注于转录因子及其相互作用伴侣。
在免疫共沉淀实验中，我们将特异性抗体与蛋白质提取物混合，并通过抗体与目标蛋白结合的亲和力将目标蛋白及其相互作用伴侣沉淀下来。
此时，我们可以通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质，并将目标蛋白及其相互作用伴侣纯化得到。
最后，我们可以使用多种方法，如免疫印迹、质谱分析等，对共沉淀下来的蛋白质进行检测和鉴定。
免疫共沉淀作为一项直接、高效的技术，在转录因子研究中有着广泛的应用。
通过免疫共沉淀，我们可以很容易地鉴定转录因子的相互作用伴侣，并进一步研究这些相互作用在基因调控中的功能。
此外，免疫共沉淀还可以用于研究转录因子与DNA的结合情况，以及转录因子在不同细胞环境中的定位。
在设计免疫共沉淀实验时，我们需要注意选择合适的抗体和对照组，以确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，在进行数据分析时，我们需要考虑到可能存在的假阳性和假阴性结果，并采取适当的对照实验和统计方法进行校正。
总之，免疫共沉淀是一项重要且有效的实验技术，对转录因子研究具有重要的指导意义。
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乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少， DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实 验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效 沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍.
rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；
将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液
洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲
液，沸水煮5分钟；
?
（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱
仪分析。
? 一、 样品处理： 二、 抗体-agarose beads孵育
异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶 液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影 响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
异丙醇： 优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低， 而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选 择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、 tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下 长时间放置。
乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别
异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候 一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一 些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游 的实验影响小 。
异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是 去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 有 时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。 在 沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇， 所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时， 用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温 下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
免疫共沉淀
(CO—immunoprecipitation)
? 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该 分子特异性结合的其他分子也会被带着一 起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合。
? 免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细 胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。
基本原理
? 细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗 原形成特异的免疫复合物，若存在与已知 抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中 还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 核苷酸序列。将中分离出cDNA克隆 。
实验流程
?
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适
量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶
抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于
4°C， 最大转速离心30 min后取上清；
?
（2）取少量裂解液以备Western blot分析，
剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解
液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
Байду номын сангаас
?
（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量
裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
?
（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖
珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中
4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼
脂糖珠偶连；
?
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000
三、 抗体-agarose beads复合物洗涤： 四、 鉴定
免疫共沉淀技术的应用
肿瘤 酶与病毒 信号传导 寄生虫
免疫共沉淀技术的优点与局限性
? 优点：
与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物；
抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效 应；
蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； 复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行，可以避免人为影响， 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体.
? 局限性:
需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛 选未知蛋白会遇到障碍。
免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合 物为直接相互作用的两种蛋白。
用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合 适，与Western blotting或者ELISA相比容易出 现假阳性反应。
灵敏度不如亲和色谱高。
不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结 构的蛋白质一蛋白质相互作用。