免疫共沉淀步骤.doc
免疫共沉淀技术原理和操作流程
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用 于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望
免疫共沉淀
1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：A.蛋白样品的准备：A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。
对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。
如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
B.去除非特异性结合(可选做)：B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。
通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
C.免疫沉淀：C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。
(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，其步骤通常包括以下几个方面：
1. 样品制备，首先需要准备含有目标蛋白质的样品，可以是细
胞提取物或者纯化的蛋白质溶液。
样品需要经过适当的处理，比如
离心、裂解等，以提取目标蛋白质。
2. 抗体结合，将目标蛋白质的抗体固定在载玻片、琼脂糖珠或
磁珠等固相载体上，形成免疫复合物。
3. 共沉淀，将制备好的抗体-蛋白质复合物与样品混合，允许
它们发生特异性结合，形成免疫共沉淀复合物。
4. 洗涤，对免疫共沉淀复合物进行洗涤，以去除非特异性结合
的蛋白质和其他杂质。
5. 蛋白质溶解，将免疫共沉淀复合物溶解于适当的缓冲液中，
以便后续的分析。
6. 分析，最后，可以使用Western blot、质谱分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）等技术对共沉淀的蛋白质进行检测和分析。
这些步骤可以帮助研究人员确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装等重要生物学过程。
同时，在进行蛋白质免疫共沉淀实验时，需要严格控制实验条件，选择合适的抗体以及适当的质控措施，以确保实验结果的准确性和可重复性。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
第一步：制备抗体或抗原
第二步：交叉链接抗体或抗原
为了增强免疫共沉淀的稳定性，可以通过交叉链接抗体或抗原来使其形成更稳定的复合物。
交叉链接可以通过化学交联剂（如戊二醛）或交叉链接抗体分子的抗体-抗体结合位点实现。
交叉链接后的抗体或抗原会形成二聚体或多聚体结构。
第三步：取样和预处理
目标蛋白所在的细胞、组织或培养上清需要经过取样和预处理来获得纯净的样本。
这通常包括细胞裂解、蛋白质提取、离心、过滤等步骤。
预处理的目的是去除可能干扰检测结果的其他蛋白质或物质。
第四步：抗体结合和免疫沉淀
将抗体加入预处理样本中，使其与目标蛋白结合。
可以选择直接加入抗体，也可以将抗体固定在固相材料上，如蛋白A/G琼脂糖小柱或磁珠，然后将样本与固相材料接触，使抗体与目标蛋白结合。
第五步：洗涤
为了去除非特异性结合或杂质，需要对固相材料进行洗涤。
洗涤缓冲液的选择和洗涤次数将影响免疫沉淀的特异性和纯度。
第六步：洗脱和分析
将洗涤后的固相材料加入一定体积的洗脱缓冲液，使免疫沉淀物从固相材料上被洗脱下来。
洗脱后的沉淀物可以进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析、蛋白质定量等。
总结：免疫共沉淀是一种用于检测和分离特定蛋白质复合物的免疫学技术。
该技术基于抗体与抗原结合的特异性，通过将目标蛋白与抗体结合并经过洗涤和洗脱步骤，实现对复合物的检测和纯化。
免疫共沉淀步骤包括制备抗体或抗原、交叉链接、取样和预处理、抗体结合、洗涤、洗脱和分析等过程。
这个技术广泛应用于生物医学研究中，可用于蛋白质相互作用的研究、药物研发和疾病诊断等领域。
免疫共沉淀流程
免疫共沉淀流程免疫共沉淀这个事儿啊，可有意思啦。
一、免疫共沉淀是啥。
简单说呢，这就是一种研究蛋白质相互作用的超酷方法。
就好比在一个超级大的派对里，我们要找到那些互相手拉手的小伙伴（蛋白质们）。
在细胞这个大派对场所里，各种蛋白质都混在一起，免疫共沉淀就像个小侦探，能把相互作用的蛋白质揪出来。
二、开始之前的准备。
1. 细胞的选择。
这就像我们要选一个合适的派对场地一样重要。
你得根据你要研究的蛋白质，选择合适的细胞类型。
比如说，如果研究跟神经相关的蛋白质相互作用，那神经细胞可能就是你的首选。
细胞的状态也很关键哦，要是细胞都病恹恹的，那可不好找相互作用的蛋白质啦，就像在一个乱糟糟的派对里找人一样难。
2. 试剂的准备。
这就像是小侦探的工具包。
我们需要有合适的抗体，这个抗体就像是专门识别某个小伙伴（蛋白质）的小标签。
还有裂解液，它能把细胞这个大派对场地给拆开，让里面的蛋白质都暴露出来。
这些试剂的质量可不能马虎，要是抗体认错了人（蛋白质），那可就全乱套了。
三、免疫共沉淀的具体流程。
1. 细胞裂解。
把细胞弄破，让里面的蛋白质都跑出来，这是很关键的一步呢。
就像打开派对场地的大门，让所有人都到广场上集合一样。
我们把细胞放在裂解液里，轻轻晃一晃，就像在轻轻地催促那些在房间里的人（蛋白质）赶紧出来。
这时候要注意温度和时间哦，要是太着急，可能会把蛋白质给弄伤了，就像在派对上太粗鲁地赶人一样不好。
2. 预清除。
这一步有点像在派对开始前，先把那些捣乱的小混混（非特异性结合的东西）给赶走。
我们把裂解液和一些没有特异性的东西混合一下，然后去掉，这样剩下的就比较纯净啦，就像让派对的场地更干净，只留下真正的参与者（我们感兴趣的蛋白质）。
3. 加入抗体。
现在我们的小侦探（抗体）要上场啦。
把专门识别我们想要研究的蛋白质的抗体加到裂解液里，这时候抗体就会像小磁铁一样，紧紧地吸住那个对应的蛋白质。
就像在派对里，我们的小侦探一眼就看到了目标人物，然后紧紧跟着他。
免疫共沉淀的详细步骤及方法
免疫共沉淀的详细步骤及方法1.实验准备在进行免疫共沉淀实验前，需要准备实验所需的材料和试剂。
这些材料和试剂包括：抗体，控制抗体，细胞提取液，蛋白质提取缓冲液，蛋白质裂解缓冲液，洗涤缓冲液，沉淀缓冲液，蛋白质样品等。
2.细胞提取及蛋白质提取收集待测细胞，用适当的缓冲液洗涤细胞，并用蛋白质提取缓冲液提取细胞内的蛋白质。
可利用机械或化学方法破裂细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
3.预清洗和前处理将蛋白质提取物进行预清洗，以去除非特异性结合物和杂质蛋白质。
预清洗通常包括四次的离心洗涤步骤，使用洗涤缓冲液。
4.抗体交联将抗体与蛋白质提取物进行交联。
将目标抗体或控制抗体与预清洗后的蛋白质提取物特异性结合，并通过化学或免疫学方法交联两者。
5.免疫沉淀实验将交联后的样品经过免疫沉淀实验。
将抗体/蛋白质复合物与蛋白质A/G琼脂糖珠或其他免疫沉淀剂结合，使复合物与琼脂糖珠发生特异性结合。
6.洗涤和收集将免疫沉淀后的琼脂糖珠用洗涤缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合物质。
洗涤次数通常为3-5次，每次洗涤约10分钟。
7.热处理和蛋白质裂解将洗涤后的琼脂糖珠在蛋白质裂解缓冲液中进行热处理。
将琼脂糖珠加入含有蛋白酶抑制剂和变性剂的裂解缓冲液中，使蛋白质从琼脂糖珠上释放出来。
8. SDS-和Western Blot分析使用SDS-技术对裂解后的蛋白质进行分离，然后进行Western Blot 分析。
Western Blot分析是通过将蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行探测，来检测特定蛋白质。
9.数据分析根据Western Blot结果来分析免疫共沉淀实验结果。
可以通过探测特定蛋白质的存在与否，以及与其他蛋白质的互作情况来推断蛋白质间的相互作用或复合物的形成。
总结免疫共沉淀是一种广泛应用于研究蛋白质结构和功能的实验技术。
其详细步骤包括：细胞提取和蛋白质提取，预清洗和前处理，抗体交联，免疫沉淀实验，洗涤和收集，热处理和蛋白质裂解，SDS-和Western Blot 分析，以及数据分析。
免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。
本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
免疫共沉淀实验流程及步骤
免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
免疫共沉淀技术流程
免疫共沉淀技术流程一、免疫共沉淀技术的准备工作。
1.1 首先呢，得把要用的材料都准备齐全喽。
这就好比做饭得先把食材都买好一样。
我们需要有合适的细胞或者组织样本，这是整个实验的基础。
细胞或组织要是没选对，那可就像盖房子地基没打好，后面全白搭。
1.2 还有抗体，这抗体啊，那可是免疫共沉淀技术里的关键角色。
就像一把精准的钥匙，要能特异性地识别我们感兴趣的蛋白质才行。
要是抗体选错了，就像拿错钥匙开错门，啥都做不成。
另外，像蛋白A或者蛋白G琼脂糖珠这些试剂也不能少，它们在后面的步骤里起着重要的作用呢。
二、细胞裂解。
2.1 细胞裂解这一步可不能马虎。
要使用合适的裂解缓冲液，这缓冲液就像是一种神奇的溶剂，能够把细胞里的蛋白质都释放出来。
就好像把一个装满宝藏（蛋白质）的盒子打开一样。
裂解的条件得控制好，温度啊、时间啊，都得恰到好处。
要是裂解过度了，就像把宝藏都给弄碎了，蛋白质结构被破坏，后续的实验就没法好好进行；要是裂解不完全呢，那很多蛋白质还被困在细胞里，就像宝藏没全拿出来，也是不行的。
2.2 在裂解的过程中，还得添加一些蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
这就像是给蛋白质派了保镖，防止它们在裂解过程中被降解或者去磷酸化。
不然的话，我们想要研究的蛋白质可能就变得面目全非了，那可就前功尽弃了。
三、免疫共沉淀反应。
3.1 把裂解后的样品和特异性抗体混合在一起，这时候就像是一场精准的约会。
抗体要去找到它对应的蛋白质，然后结合在一起。
这个过程需要在合适的环境下进行，比如说合适的温度和搅拌条件。
就像约会得找个合适的地方，还得有点互动才行。
3.2 接着呢，加入蛋白A或者蛋白G琼脂糖珠。
这些琼脂糖珠就像是小磁铁，能够把和抗体结合在一起的蛋白质复合物吸附过来。
这一步就像是用网把约会的一对儿（抗体蛋白质复合物）给捞起来一样。
然后经过离心等操作，把吸附了复合物的琼脂糖珠沉淀下来，而那些没有结合的东西就被去掉了，就像把杂质都筛掉，只留下我们想要的精华部分。
免疫共沉淀
免疫沉淀
试剂配制：
细胞裂解液：50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40以及1%脱氧胆酸钠；
洗涤缓冲液：不含NP-40的细胞裂解液。
操作步骤：
（1）用LP78(8µg/mL)或poly(I:C)（3µg/mL）刺激NHEK细胞12h。
刺激完后，用PBS洗两次，加入细胞裂解液于冰上裂解细胞，收集细胞蛋白，
10000rpm，4℃，10min。
（2）测蛋白浓度，稀释至1mg/mL。
加入15µL的protein AG进行预孵育，以去除蛋白质与protein AG的非特异性结合。
按照0.5mg总蛋白加入
1µg目标抗体，或0.5mg总蛋白加入1µg IgG孵育，所有组留蛋白做Input
对照。
加入抗体后，将蛋白放于摇床上温和摇2 h（4℃）。
（3）加Protein AG。
加入20µL的protein AG，于4℃在摇床上温和摇2 h进行孵育。
（4）离心弃上清，用洗涤缓冲液洗沉淀2-3次，尽可能移去沉淀上方液体。
（5）加人20-30 µL的电泳上样缓冲液，于100℃煮5-10 min，离心收集上清。
进行免疫印迹实验。
免疫共沉淀实验方法与操作步骤
免疫共沉淀实验方法与操作步骤免疫共沉淀（Immuno-precipitation，简称IP）是一种用于研究蛋白质间相互作用的分子生物学技术。
该技术主要通过将抗体与蛋白质结合，然后利用纯化方法将其他与该蛋白质相互作用的蛋白质一起沉淀下来。
以下是免疫共沉淀实验的方法和操作步骤：实验方法：1.设计实验：首先要明确要研究的目标蛋白质的特性，选择合适的实验条件和抗体。
2.制备样品：提取和纯化目标蛋白质样品，可以使用细胞裂解、分离技术等方法获得纯度较高的样品。
3.选择抗体：根据目标蛋白质的性质和已有的文献，选择合适的抗体。
可以选择专一性较高的单克隆抗体，或使用多个抗体以增加实验结果的可靠性。
4.交联抗体：使用足够浓度的亲和素，将抗体与纯化的亲和素交联。
5.准备阻断物：阻断物可以用于防止非特异性结合，在进行共沉淀实验时添加适量的BSA、奶粉等阻断物。
6.制备阳性对照：在同一实验中添加阳性对照，以验证实验的可行性及抗体的有效性。
7.孵育样品：将目标蛋白质样品与抗体复合物孵育在特定的缓冲液条件下，通常需要孵育12至24小时，以确保充分的结合。
8.添加亲和素：添加与抗体结合的亲和素（如蛋白A、蛋白G等），使抗原-抗体结合物与亲和素结合。
9.沉淀抗原-抗体复合物：通过添加亲和素的磁珠、琼脂糖或琼脂脂球等材料，将抗原-抗体复合物沉淀下来。
10.洗涤：使用高浓度的洗涤缓冲液，将非特异性结合和杂质物质洗掉。
11.洗涤完毕后，用洗涤缓冲液再洗30s,然后将磁珠用有效药液（如样本缓冲液）悬浮。
12.洗涤和沉淀：重复洗涤步骤2至3次以增加纯度，然后使用洗涤缓冲液将沉淀的样品转移到新的离心管中。
13.洗涤完毕后，去除冗余的缓冲液。
14.脱附和洗脱：使用脱附缓冲液将目标蛋白质从磁珠上脱附下来。
15.分析和检测：将洗脱的蛋白质样品用于Western blotting、质谱分析等方法进行进一步的研究和检测。
操作步骤：1.将目标蛋白质样品溶解在特定的细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。
蛋白质免疫共沉淀实验
蛋白质免疫共沉淀实验引言：蛋白质免疫共沉淀实验是一种广泛应用于生物学研究中的实验技术，通过利用抗体的高度特异性与目标蛋白的结合，实现对目标蛋白的分离和鉴定，从而揭示蛋白质相互作用网络及其功能。
本文将详细介绍蛋白质免疫共沉淀实验的原理、步骤以及应用。
一、原理：蛋白质免疫共沉淀实验是基于免疫学原理开展的。
当外源抗原（目标蛋白）与机体内的免疫系统接触后，机体会产生相应的抗体。
这些抗体具有高度特异性，可以与目标蛋白结合形成免疫复合物。
在免疫共沉淀实验中，我们通过将抗体固定在固相上（如琼脂糖或磁珠），使其能够特异性地结合目标蛋白，然后通过洗涤等步骤将非特异性结合的蛋白去除，最终得到含有目标蛋白的复合物。
二、步骤：1. 提取蛋白：首先，从细胞或组织中提取含有目标蛋白的总蛋白。
可以使用细胞裂解液或特定的蛋白提取缓冲液进行细胞裂解，释放细胞内的蛋白。
2. 抗体固定：将抗体固定在固相上，如琼脂糖或磁珠。
这些固相材料具有大量的活性基团，可以与抗体发生共价结合，形成固定的抗体。
3. 免疫沉淀：将提取的总蛋白与固定的抗体进行免疫反应。
在适当的条件下，目标蛋白与固相上的抗体结合形成免疫复合物。
4. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白。
洗涤缓冲液的成分和洗涤次数需要根据实验需要进行调整，以确保获得高纯度的复合物。
5. 蛋白析出：将洗涤后的固相与适当的缓冲液进行洗脱，将目标蛋白从抗体固定上释放下来。
6. 蛋白分析：经过免疫共沉淀实验后，可以使用Western blot、质谱等技术对蛋白进行进一步鉴定和分析，以验证目标蛋白的特异性。
三、应用：蛋白质免疫共沉淀实验在生物学研究中具有广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：1. 蛋白质相互作用：通过免疫共沉淀实验可以鉴定蛋白与蛋白之间的相互作用关系，揭示蛋白质相互作用网络及其功能。
2. 信号转导：通过免疫共沉淀实验可以鉴定信号通路中的关键蛋白，深入了解信号传导机制。
3. 疾病机制：通过免疫共沉淀实验可以鉴定与疾病相关的蛋白质，揭示疾病的分子机制，为疾病的诊断和治疗提供新的靶点。
免疫共沉淀详细步骤
免疫共沉淀详细步骤1.准备样品：首先，准备含有目标蛋白质的细胞提取物或纯化的蛋白质样品。
样品的制备通常包括细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取等步骤。
2.预处理样品：根据实验需要，对样品进行预处理。
例如，可以使用蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂来避免蛋白质的降解或被磷酸化。
此外，也可以通过交联反应来固定蛋白质与其相互作用的分子，以增加免疫共沉淀的稳定性。
3.选择适当的抗体：根据目标蛋白质的特异性，选择适当的单克隆或多克隆抗体。
这些抗体可以是经过商业购买的，也可以是实验室自行制备的。
4.免疫沉淀：将适当的抗体与蛋白质样品混合，形成免疫复合物。
为了增加抗原与抗体的结合效率，可以在混合物中添加增强抗体结合的缓冲剂，如牛血清白蛋白（BSA），牛血清或鱼籽酸-Na等。
将混合物孵育在4°C下，允许抗体与抗原结合。
5.加入固相支持：免疫复合物通常不稳定，为了将其固定，需要将其与固相支持材料结合。
常用的固相支持材料包括蛋白A/G琼脂糖或抗体包被的琼脂糖小珠。
将适当量的支持材料添加到混合物中，并在4°C下搅拌孵育一段时间，以允许免疫复合物与支持材料结合。
6.沉淀：将混合物通过离心使免疫复合物沉淀到底物质上，将上清液去除。
7.洗涤：用洗涤缓冲液多次清洗底物质来除去非特异性的结合物质，以提高纯度。
洗涤缓冲液的成分可以根据实验样品的特点和所用抗体的特性来调整。
8.洗涤后处理：根据实验需要，可以加入洗涤后处理剂，如酶解抑制剂、的士速根-Na、蛋白酶抑制剂等。
9.构建免疫复合物：为了从固相支持上解离免疫复合物，可以使用低pH或高盐浓度的洗涤缓冲液。
免疫复合物被解离后，可以用于进一步的分析，如免疫印迹、质谱分析等。
10. 分析：通过适当的方法对免疫复合物进行分析。
常用的分析方法包括SDS-、Western blot、质谱分析等。
免疫共沉淀方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值。
在实验过程中，需要注意的是选择适当的抗体和固相支持材料，以及适当的控制实验条件，如反应时间和温度等。
免疫共沉淀的原理及应用
免疫共沉淀的原理及应用1. 原理免疫共沉淀是一种常用的生物化学技术，用于检测蛋白质与其他蛋白质或分子的相互作用关系。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后将抗体与结合的蛋白质一起沉淀下来。
通过这种方法可以分离出与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质或分子。
免疫共沉淀的步骤如下：1.样品制备：将待测的细胞或组织样品裂解，释放出蛋白质。
2.抗体结合：加入特异性抗体，将其与目标蛋白质结合。
3.免疫共沉淀：加入沉淀剂，使抗体与结合的蛋白质形成复合物，并沉淀下来。
4.洗涤：洗涤复合物，去除非特异性结合的蛋白质。
5.蛋白质释放：将目标蛋白质与与之相互作用的蛋白质从复合物中释放出来。
6.分析：通过Western blot、质谱等技术对释放出的蛋白质进行分析。
2. 应用免疫共沉淀技术在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：2.1 蛋白质相互作用网络研究免疫共沉淀技术可以用于分离和鉴定与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质，从而帮助构建蛋白质相互作用网络。
这对于研究细胞信号传导、蛋白质功能和疾病机制等方面具有重要意义。
2.2 蛋白质纯化和鉴定免疫共沉淀技术可以用于纯化目标蛋白质，特别是与其他蛋白质相互作用的复合物。
通过免疫共沉淀，可以去除其他干扰蛋白质，从而提高目标蛋白质的纯度。
此外，通过鉴定与目标蛋白质共沉淀的蛋白质，可以帮助研究者了解目标蛋白质的生物功能。
2.3 药物研发免疫共沉淀技术可以用于筛选与目标蛋白质相互作用的化合物，作为药物研发的候选。
通过免疫共沉淀，可以鉴定与目标蛋白质相互作用的小分子化合物，并评估其对蛋白质功能的影响。
这为新药物的研发提供了重要的依据。
2.4 信号转导途径研究免疫共沉淀技术可以帮助研究细胞信号转导途径中关键蛋白质的相互作用关系。
通过分析与信号转导途径相关的蛋白质复合物，可以揭示信号传递的分子机制，为疾病诊断和治疗提供新的思路。
3. 结论免疫共沉淀技术是一项重要的生物化学技术，通过特异性抗体与目标蛋白质结合，可以分离和鉴定与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质或分子。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。
该方法利用抗体与目标蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。
下面将详细介绍免疫共沉淀的实验原理及步骤。
实验原理：在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。
然后将这种特异性抗体抵结的蛋白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。
实验步骤：1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或动物模型中提取目标蛋白。
将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。
2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固相支架。
特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。
3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相支架上的抗体结合。
4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质分子从固相支架上洗脱。
一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。
5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的特异性抵结复合物分离出来。
这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或检测。
6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。
总结：免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或检测蛋白质的方法。
这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。
免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。
免疫共沉淀步骤
免疫共沉淀1、收集细胞样品，水平转子1000rpm离心2min，去上清，将细胞沉淀放在液氮里速冻，后置于冰上；2、每管加入200ul的IP裂解液，涡旋仪上震荡30s；3、取20ul上清加入到新的EP管中，然后加入loading buffer，95度加热5min，作为input；4、再向步骤4中的样品管里加入320ul的IP裂解液，震荡1min；5、13000rpm 4度离心10min；6、将上清转移到加入anti-FLAG beads的EP管中，4度摇晃孵育3h；7、13000rpm 4度离心10s，去上清；8、加入500ul IP buffer 洗涤5次；9、加入500ul 50mM Tris-HCl PH7.5洗涤1次，将triton除净；10、每管加入蛋白loading buffer，94度加热10min；11、13000rpm 4度离心2min；12、将样品进行western检测分析。
IP裂解液配方(50 ml)1 M HEPEs (PH7.5) 10 mM 0.5 ml5 M NaCl100 mM 1 ml0.5 M EDTA 1 mM 0.1 ml50% 甘油10% 10 ml10% Triton 1% 5 ml 1片蛋白酶抑制剂dH2O 补水至50 ml 于摇晃器上摇晃混匀，分装成2ml小管，-20度保存。
IP洗涤液配方(50 ml)试剂终浓度用量1 M HEPEs (PH7.5) 10 mM 0.5 ml5 M NaCl100 mM 1 ml0.5 M EDTA 1 mM 0.1 ml50% 甘油10% 10 ml 10% Triton 1% 5 mldH2O 补水至50 ml 于摇晃器上摇晃混匀，4度保存。
免疫共沉淀技术实验步骤
免疫共沉淀技术实验步骤免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。
实验步骤详解：一、细胞总裂解液的制备①转染后24h收集细胞，1400r X 3min，4°C离心，弃去上层培养基②冰上静置裂解细胞，加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀，冰上静置10-15min。
注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂，通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml)③12000 x 5-10min, 4°C离心④将离心后的上清液转移至新的EP管内，每管转移的量保持一致，注意不要吸到底部沉淀，全程冰上操作二、免疫共沉淀①留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min，作为input组②提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内，要使用剪去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。
1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体③4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶，准备下一步Western blotting)④Binding结束，1400r x 1min, 4°C离心⑤真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul NETN，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来⑥离心，重复4)5)，洗beads三次⑦最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为Co-IP组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次，作为IP组点样。
免疫共沉淀详细步骤
免疫共沉淀详细步骤实验原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
实验试剂1. RIPA Buffer配制：基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）NaF（200mM的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂2. 工作液配制：配制100ml的modified RIPA buffer：1) 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.42) 加10 ml 10%的NP-403) 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4) 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存5) 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
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具体步骤：
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤 2 次，最后洗涤完成后吸干PBS液。
2. 加入预冷的RIPA Buffer（ 1ml/107 个细胞、 6cm 培养皿、 75cm2 培养瓶）。
3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入管中，EP 管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min 。
4.4℃， 14000g 离心 15min 。
5.立即将上清液转移到一个新的离心管中。
6. 准备 Protein A 琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。
*为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。
7. 每 ml 总蛋白中加入100ul Protein A 琼脂糖珠（ 50%）， EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃 10min 。
*目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。
8.4℃， 14000g 离心 15min ，将上清转移到一个新的离心管中。
9.测定蛋白浓度，可选用 Bradford 法做蛋白标准曲线。
10.蛋白定量，分装， -20℃保存，可保存 1 个月。
11.用 PBS液将总蛋白稀释至约 1ug/ml 。
12.加入 500ul 稀释好的兔抗到总蛋白中。
13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。
14. 加入 100ul Protein A 琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。
15.14000rpm 瞬时离心 5s，去上清，收集琼脂糖珠 -抗原抗体的复合物。
16.用 800ul 预冷 RIPA buffer 冲洗 3 遍。
17.用 60ul 2 倍上样缓冲液将琼脂糖珠 -抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。
18.将上样样品煮 5min 。
19.14000g 离心，收集剩余琼脂糖珠。
20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
21.上清也可以暂时冻 -20℃，留待以后电泳。
基础成分
（1） Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分）
（2） NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分）
（3） NP-40（用 H2O 配置成 10%储存液。
NP-40 为非离子去污剂，用于提取蛋白）
（4）去氧胆酸钠（用 H2O 配置成 10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存）
*因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去
氧胆酸钠。