重组腺相关病毒rAAV在神经科学中的应用
重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9的构建及其对体外培养的大鼠耳蜗组织的转染
ｐ Ｓ Ｈ — ＭＶ— Ｄ Ｆ９ ｐ ｓ ｄｗ ｓｎｒｄ ｃｄｉｔ ２ ３ｃｌｂ ｔｏ ｆ ａ （ Ｏ ） ｓ ｇｔｒｅｐ ｓ ｉｓ ＳＶ Ｇ Ｃ Ａ Ｎ ． ｌ ｍｉ ａ ｔ ｕｅ ｏ ９ ｅｌ ｙｍｅ ｄｏ ３ Ｐ ４ ２ ｉ ｅ ｌ ｍ ｄ ａ ｉ ｏ ｎ ｈ Ｃ ｕｎ ｈ ａ
要 ］ 目的 ： 包装携载神经 营养素 （ Ｔ ） Ｎ ４ 与活性依赖性 神经营养 因子＿（ Ｄ Ｆ９ ９ Ａ Ｎ － ）融合基 因的重组 腺相关病 毒
ｒ Ａ －Ｔ － Ｄ Ｆ９ 并观察该重组病毒对 体外培养 的耳蜗组织 的转染 。方法 ： Ａ Ｖ Ｎ ４Ａ Ｎ －， 使用 ｐ Ｓ Ｇ Ｃ ． Ｔ ． Ｄ Ｆ９ ｐ Ｆ ４ Ｓ Ｈ ．ＭＶ Ｎ ４Ａ Ｎ － ，Ｇ １０ 和 ｐ Ａ ／ ｄ３种质粒共转 染 ２ ３包装细胞 ， Ａ Ｖ Ａ ９ 制备 Ａ Ｎ － Ｄ Ｆ９重组 腺相关病毒 （ｅｏ ｂｎｔ ａｅｏａｓｃ ｔｄｖ ｕ ． Ａ Ｖ） ｒｃｍ ｉａ ｄ ｎ．ｓｏｉ ｅ ｉ ｓ ｒ Ａ ． ｅ ａ ｒ 应用斑点 杂交 实验检测重组病毒滴度 ； 体外 分离 培养新 生 Ｓ Ｄ大 鼠的耳 蜗 毛细胞 ； 重组 病 毒感染 体外 培养 的新 生 将 Ｓ Ｄ大 鼠耳蜗毛细胞 ， ２ 提取组织行 反转 录・ 于 ４ｈ后 聚合 酶链式反应 （ ＴＰ Ｒ 以检测 ｒ Ａ ．Ｔ ． Ｄ Ｆ９对耳蜗的转 Ｒ ．Ｃ ） Ａ Ｖ Ｎ ４Ａ Ｎ － 染 。结果 ： 应用斑点 杂交实验检测重组病 毒滴 度为 ２×１ ｃ ／ ｌ表 明成功地 构建 了重组 Ａ Ｖ载体 。成功分离培养 ０ ｆ ｍ， ｕ Ａ
［ 中图分类号 ］ Ｒ ６ ；Ｑ ８ ７ ４ ７２
［ 文献标 志码 ］ Ａ
［ 文章编号 ］ １７ ７ ８ （０ ８ ０ ０ ７ ０ ６ １— ７３ ２ ０ ）４— ２ ７— ４
重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响
重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响车彦军;林志国;沈红;宋武奇;刘利;李晓波;张凤民【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2007(027)004【摘要】目的研究重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus,rAAV)载体对原代培养的神经于细胞(neural stem cells,NSC)的体外转染及其对细胞增殖、分化和迁移能力的影响.方法取新生24 h内的Wistar大鼠的海马进行神经干细胞原代培养,用不同滴度的rAAV为载体,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因作为报告基因进行体外转染NSC,通过观察有绿色荧光的Nsc的数量,测定rAAV对NSC的体外转染情况;用MTT法测定不同病毒滴度下rAAV对NSC增殖能力的影响,用免疫组化法鉴定NSC、神经元及神经胶质细胞,并在倒置荧光显微镜下直接测定细胞的迁移距离.结果 rAAV对NSC的体外转染效率随着病毒滴度的增加而提高,在转染后的第11天表达水平最高,用MOI为104、105、106的rAAV转染后第11天的转导率分别是9.81%、56.30%、64.67%;不同滴度rAAV转染NSC后不同时间点的MTT测定A值随着病毒滴度的增加而明显减小,差异均有统计学意义;但不同滴度rAAV转染NSC,其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离未见差异.结论较高滴度(MOI为105和106)的rAAV可以在体外有效地转染神经干细胞,且不影响神经干细胞的分化和迁移能力,但对其增殖能力有明显抑制,并表现为病毒滴度依赖性.【总页数】6页(P343-348)【作者】车彦军;林志国;沈红;宋武奇;刘利;李晓波;张凤民【作者单位】150001,哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科;150001,哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科;150001,哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科;150086,哈尔滨医科大学基础医学院微生物教研室;150001,哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科;150086,哈尔滨医科大学基础医学院微生物教研室;150086,哈尔滨医科大学基础医学院微生物教研室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.重组腺相关病毒转染神经干细胞球的实验研究2.9型重组腺相关病毒转染大鼠心脏成纤维细胞的体外研究3.腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子对体外转染恒河猴和人腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原影响的比较4.脑源性神经营养因子基因重组腺病毒体外转染胚胎大鼠神经干细胞及其鉴定5.2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白对培养神经干细胞转染效率的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RNA干扰技术在神经科学中的应用
RNA干扰技术在神经科学中的应用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是一种常用于基因沉默的技术。
它通过人工合成一种小分子RNA，把它导入到细胞内，与细胞自身的mRNA结合并沉默目标基因。
RNAi 技术在过去的十多年里在各种生物系统中广泛使用。
近年来，越来越多的研究表明，RNAi技术在神经科学中也有广泛的应用。
神经系统是一个复杂的系统，在体内细胞和神经元之间通讯的过程中涉及到了诸多因素。
RNA干扰技术的应用，能够为神经科学研究提供一种全新的工具。
下面，我将分别从以下两个方面，探讨RNA干扰技术在神经科学研究中的应用：一、RNA干扰技术在神经元成型与变异中的应用人类大脑具有极高的可塑性，即在成长过程中，个体的大脑一直在不断的变化。
这些变化与大脑神经元之间的结构和连通关系有很大的关系。
RNA干扰技术可以使研究者在特定时间点对基因进行沉默，从而模拟体内神经元发育的过程，观察特定基因在神经元成型与变异中的作用。
科学家们发现，RNA干扰技术可以用于研究多种神经元的成型和变异，例如视网膜神经元、天蓝电脑神经元、单脏神经元和脊髓神经元等。
通过研究基因的沉默与神经元发育的关系，科学家们发现了一些新的调控因子和信号通路，这些发现有助于我们更好地理解大脑的变化与神经元的复杂结构。
二、RNA干扰技术在神经退行性疾病中的应用神经退行性疾病是指由于人体神经系统的逐渐损坏而产生的一系列疾病。
这一类疾病的临床症状主要表现为记忆力减退、行动不便、视觉以及语言、认知功能下降等。
RNA干扰技术因为其具有靶向性强、针对性好、副作用少等优点，成为了研究神经退行性疾病的热门技术。
近年来，科学家们利用RNA干扰技术成功地抑制了β淀粉样蛋白的合成，从而控制了阿尔茨海默病的发生和发展。
此外，RNA干扰技术还被用于研究其他各种神经退行性疾病，例如亨廷顿舞蹈病、帕金森病、多发性硬化病等。
总结RNA干扰技术在神经科学研究中有广泛的应用。
腺相关病毒（AAV）是什么？
腺相关病毒（AAV）是什么？
腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA病毒，目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。
它由蛋白衣壳（capside）和长度为4.7kb 的单链DNA基因组构成。
蛋白衣壳由三个亚基组成，分别为VP1，VP2，和VP3。
AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。
这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。
作为基因疗法载体的重组腺相关病毒（rAAV）携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，取而代之的是治疗性转基因（transgene）。
AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。
将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。
rAAV在感染细胞后会头尾相连形成环状，能长期存在而不被细胞系统当作外源DNA降解，因此可以在哺乳动物器官或组织中长期保留，并且只有极低的整合基因组机率。
这个特性使AAV成为基因治疗的首选载体，也同样成为科学研究中在动物体内传递外源基因的一个优异载体。
AAV作为新一代基因治疗载体，还有一个很重要的特性在于其特异性强。
得益于AAV的不同血清型，每种血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力，配合以合适的注射方法，会取得更好的效果。
如果您做动物实验，建议首选AAV。
2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干细胞
2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干细胞背景介绍神经干细胞是一种具有自我更新和分化能力的细胞，可以分化成多种神经元和胶质细胞。
这些细胞可以作为治疗神经系统疾病的潜在细胞治疗策略的一部分。
神经干细胞的体外培养和扩增技术是这种细胞疗法实现的关键，在这个过程中需要使用病毒载体将外源基因导入到神经干细胞中。
绿色荧光蛋白（GFP）是一种广泛用于细胞成像和标记的分子工具。
2型腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是一种常用的病毒载体，具有良好的安全性和免疫原性较低的优点。
因此，在神经干细胞治疗中，2型腺相关病毒重组GFP 转染体外培养神经干细胞已成为一种常用的策略。
方法描述在2型腺相关病毒中，替换掉Ad-β-gal基因为GFP基因。
将这个病毒合成并纯化后，用它将GFP基因导入到神经干细胞中。
在体外培养神经干细胞时，将病毒加入培养基中。
病毒感染培养基中的神经干细胞，导入GFP基因。
GFP的表达可以监测神经干细胞和它们的分化产物。
结果展示在36小时后，它们对GFP进行荧光显微镜成像。
绿色荧光明显可见，证明重组GFP已成功导入神经干细胞。
同时，这种技术使追踪分化中的神经干细胞更加简单易行，并有助于确定神经干细胞的生长和分化状态。
结论2型腺相关病毒重组GFP转染体外培养神经干细胞，可成功实现GFP基因导入。
这种方法可以作为神经干细胞成像、标记和治疗中的一个有效手段。
参考资料1.Snyder EY, Taylor RM, Wolfe JH. Neural progenitor cell engraftmentcorrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature.1995;374(6520):367-370.2.Kim SU, Nakagawa E, Hatori K. Gene therapy for neurologicaldisorders. Lancet Neurol. 2006 Jan;5(1):43-50.。
腺相关病毒（AAV）是什么？AAV质粒系统概述
腺相关病毒（AAV）是什么？AAV质粒系统概述腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV) 是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。
重组腺相关病毒（recombinant AAV, rAAV）是利用AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体，可将目的基因的CDS 区序列或者RNAi 干扰序列插入rAAV 表达质粒中，包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。
腺相关病毒具有感染温和，免疫原性小，长效稳定表达的特点，主要应用于动物体内注射。
AAV能够以低免疫应答和低毒性转导分裂和非分裂细胞。
尽管重组AAV不能整合到宿主基因组中，转基因的表达可以是长期的。
AAV 的效用目前受到其小包装容量的限制(包括ITRs在内为4.5 kb)，尽管人们对扩大这一容量有很大的兴趣和努力。
传统上，AAV要求存在另一种“辅助”病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以便繁殖。
这是由于AAV依赖于某些介导AAV复制的外源基因产物。
这一要求已经被“无辅助病毒系统”所回避，该系统能够在不使用辅助病毒的情况下产生传染性AAV粒子。
相反，在AAV生产期间，特定的基因产物可以由辅助质粒(例如，pHelper)和特定的包装细胞系(例如，HEK293细胞)提供。
AAV质粒系统概述AAV组织特异性基因治疗临床试验多采用病毒作为基因载体，提高载体的有效性和靶向性是研究病毒的重要内容。
不同的血清型AAV载体的靶向组织具有差异性，因此选择合适的AAV载体能够大大提高基因治疗的效果。
下表为了不同血清型的AAV及其特定靶向组织。
腺病毒和腺相关病毒的区别。
腺伴随病毒介导的神经营养素4基因对视网膜神经节细胞的转染
腺伴随病毒介导的神经营养素4基因对视网膜神经节细胞的转染李海燕;赵家良;张华【期刊名称】《中华实验眼科杂志》【年(卷),期】2007(025)007【摘要】目的应用重组腺伴随病毒载体介导的神经营养素4(rAAV-NT4)基因转染鼠视网膜神经节细胞(RGCs),探讨转染后对细胞生长活性和凋亡的影响. 方法应用rAAV-NT4转染培养的RGCs,RT-PCR检测外源性NT4基因在RGCs中的表达,ELISA法检测细胞培养液中NT4的质量浓度,MTT法分析转染细胞生物活性,流式细胞学法检测转染细胞的凋亡比率. 结果 RT-PCR显示转染细胞表达外源性NT4基因,转染14 d后培养液中NT4的质量浓度与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).转染6 d和9 d OD值与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).rAAV-NT4转染细胞与对照组的凋亡比率差异无统计学意义(P＞0.05).结论rAAV-NT4可有效转染鼠RGCs,转染细胞可表达外源性NT4基因,生长活性改善.【总页数】4页(P533-536)【作者】李海燕;赵家良;张华【作者单位】上海爱尔眼科医院,200336;100730,北京,北京协和医院眼科中国医学科学院北京协和医院眼科;100730,北京,北京协和医院眼科中国医学科学院北京协和医院眼科【正文语种】中文【中图分类】R774.1【相关文献】1.腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细转染的实验研究 [J], 李海燕;赵家良;张华2.重组腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对SD大鼠视网膜神经细胞及血管内皮细胞的影响 [J], 宋哲;黎晓新;于文贞;董建强;闫征3.腺伴随病毒介导 ADNF-9基因转染对豚鼠卡那霉素致聋的治疗作用 [J], 景阳;郑国玺;祝康;刘晖;张文4.AAV介导HO-1基因转染对视网膜色素变性大鼠视网膜的保护作用 [J], 梁郁萍;陈蔚琪;洪玉;高秀云;郭茂生5.AAV介导HO-1基因转染对视网膜色素变性大鼠视网膜的保护作用 [J], 梁郁萍;陈蔚琪;洪玉;高秀云;郭茂生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人神经生长因子重组腺伴随病毒载体的构建
2. 4
hNGF 重组腺伴随病毒测定
地高辛标记的斑
228
西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ）
第 25 卷
点杂交结果显示稀释 64 倍的病毒液与稀释 100 倍的 腺伴随病毒穿梭质粒载体的杂交信号一致。病毒滴 度的计算过程如下： （ 7 060 bp 质粒 pSSHG / hNGF 的相对分子质量 = + 726 bp）× 635 = 4 944 110 未稀释时每 µL 的质粒已定量为 1 µg， 则每 µg 质粒中的分子个数 = 摩尔常数 / 相对分子质量 = 6. 02 × 10 24 × 2 / 4 944 110 = 2. 44 × 10 12 个分子・ µg - 1 ， 即 病毒颗粒 = 2. 44 × 10 10 × 64 ≈1. 46 × 10 12 PFU・mL - 1
图2 Fig. 2 pSSHG-Neo / hNGF 的酶切鉴定 Identification of pSSHG-Neo / hNGF
A：pSSHG-Neo / hNGF plasmid B：pSSHG-Neo / hNGF BamHⅠ C：pSSHG-Neo / hNGF KpnⅠ D：pSSHG-Neo / hNGF EcoRⅠ E：pSSHG-Neo / hNGF BamHⅠand KpnⅠ F： 200 bp DNA ladder；G：DNA / Hind Ⅲ
3期
马
巍， 刘
淼， 杨广笑， 等. 人神经生长因子重组腺伴随病毒载体的构建
227
工程公司提供。 1. 2 方法 重组质粒 pGEM-T / hNGF 及病毒载体质 粒 pSSHG-Neo， 用碱裂解法大量制备。用限制性内切 酶 EcoRⅠ、 BamHⅠ、 KpnⅠ联合酶切质粒 pSSHG-Neo 和 pGEM / hNGF， 制备并连接带有相同粘性末端的质 粒及全长 hNGF 目的基因。 用连接反应物转化制备好的感受态细菌 E. coli DH5a 菌株， 涂于含 X-gal 和 IPIG 的琼脂板上， 挑选 单菌落接种于 LB 培养液中， 碱裂解法小提质粒， 用 限制性内切酶 EcoR Ⅰ 和 BamH Ⅰ 联合酶切， 筛选出 含有 770 bp 左右的重组质粒 pSSHG / hNGF。 将大量制备的 pSSHG / hNGF， 辅助质 粒 pAAV / Ad 及腺病毒质粒 pFG140 应用 DNA-磷酸钙共沉淀 法介导三质粒加至 80% 融合的 293 细胞培养瓶中共 转染。显微镜下见到细胞表面有细密的沉淀形成。 加入 10% （ 体积分数） 胎牛血清的 1640 培养基， 37 ℃ CO2 培养箱培养 72 h。 重组病毒颗粒的回收与纯化： 在培养液中加入细 胞悬液， 反复冻融， 取细胞裂解液 56 ℃ 水浴， 灭活腺 病毒， 透析离心取上清， 用蔗糖梯度离心法纯化病毒 颗粒。 病毒滴度的测定： 标记探针定量， 应用斑点杂交 法观察实验结果， 确定重组病毒滴度。 2 2. 1 结 果 重 组 腺 伴 随 病 毒 穿 梭 表 达 载 体 pSSHG-Neo / 2 型腺伴随病毒载体 pSSHG-Neo 是
重组腺相关病毒rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP精确转导自杀基因并抑制膀胱肿瘤生长的研究
重组腺相关病毒rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP精确转导自杀基因并抑制膀胱肿瘤生长的研究近年来，腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）作为基因传递载体广泛应用于基因治疗领域。
重组腺相关病毒（rAAV）能够有效地转导目标细胞，并将特定基因序列导入目标细胞内部，从而实现基因治疗的目的。
腺相关病毒9型（rAAV9）是当前应用最广泛且具有较高转导效率的病毒载体之一。
近期的研究表明，rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP能够精确转导自杀基因，并抑制膀胱肿瘤的生长。
在这项研究中，研究人员首先构建了一个rAAV9载体，将自杀基因与荧光标记基因连为一体，以便观察转导效率和基因表达情况。
然后，使用体外和体内实验验证了rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP的转导效能和抑制膀胱肿瘤生长的作用。
体外实验中，研究人员选择了人膀胱肿瘤细胞系，将rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP导入其中，并通过荧光显微镜观察GFP的表达情况。
结果显示，rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP能够高效转导膀胱肿瘤细胞，并且表达的GFP可以通过荧光显微镜直观观察到。
进一步的实验表明，rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP导入的膀胱肿瘤细胞表达的自杀基因能够诱导细胞凋亡，有效抑制细胞增殖。
为了验证rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP在体内的转导效能和抗肿瘤作用，研究人员选择小鼠作为实验模型。
将rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP注射到小鼠膀胱肿瘤模型中，通过活体荧光成像技术观察GFP的表达情况和肿瘤生长情况。
实验结果显示，rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP能够准确而高效地转导膀胱肿瘤组织，并且GFP表达与肿瘤体积呈负相关，证明了rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP对膀胱肿瘤生长的抑制作用。
此外，研究人员还进一步研究了rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP的安全性。
通过检测小鼠的肝、肾等主要器官的病理变化和生化指标，结果显示rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP没有引起明显的毒性和损伤，证明了其安全性。
AAV在肝脏及眼部中的应用
ITRS是AAV病毒基因组复制和包装成病毒颗粒所必需的唯一顺式作用元件，其他结构和非结构蛋白可通过反式作用提供。
rAAV的构建通常涉及rep 和cap 基因的剔除和报告基因或治疗基因插入ITRs元件之间，产生的载体质粒随后与一个表达AAV的rep和cap基因的包装质粒一起共转染到组织培养细胞中。
带有报告基因或外源基因的重组AAV基因组就会被拯救、复制和包装成rAAV[11]，如图1所示。
图 1 AAV野生型及AAV载体基因组结构从1966年第一篇报道发现AAV是独立于腺病毒的新病毒起，到1984年第一篇应用rAAV为载体感染哺乳动物细胞的文章发表，rAAV作为一种新型病毒载体引起广泛关注，目前对其应用研究主要集中于以之为载体的基因治疗[10]。
相关临床应用的推进过程较为慎重缓慢，将rAAV注射进机体组织中，可以在动物或人体内获得长期有效的转基因表达，所涉及的组织器官包括肌肉组织、造血干细胞、心血管系统、肿瘤组织、中枢神经系统、呼吸道和肺的上皮组织等，其中最有效的是骨骼肌、脑、视网膜、肝脏、肠道固有层，所涉及的疾病包括ɑ1-抗胰蛋白酶缺乏症、老年性肌肉萎缩、凝血因子缺陷症、帕金森病、肿瘤等。
但rAAV载体在应用时也要注意一些不足之处，如包装外源基因的容量小于4.7 kb、滴度低和表达“滞后性”，即被转染细胞重组AAV-DNA转变为转录活跃的双链模式需要一定的时间等[2, 5]。
2. rAAV在肝脏疾病基因治疗中的应用2.1 肝脏及肝脏疾病肝脏是人体最大的实质性器官，也是人体的代谢中心器官，参与分泌胆汁、代谢、凝血、解毒及免疫等多项重要而复杂的生理功能，承担着人体内营养物质的消化，能量转换，解毒等重要的代谢功能。
肝脏是最先被用于基因治疗的器官之一，国内外科研人员开始探索利用日新月异的分子生物学技术对肝脏疾病进行基因水平上的治疗，力图走出对症治疗的常规思路，从根本上阻断肝脏疾病的发生发展。
但随着研究的深入，人们发现肝细胞是最难转化的细胞之一。
腺相关病毒的特性及应用进展
腺相关病毒的特性及应用进展石亮【摘要】腺相关病毒(AAV)是一种重要的载体.它与反转录病毒、慢病毒、腺病毒相比有不同的特点,如长期表达,安全性高,免疫原性低,高滴度生产能力,对某些组织感染效率高等.经过十多年的研究,它的生物特性已经被深入了解.在医学上,广泛应用于疾病的基因治疗,如糖尿病、乙型肝炎、癌症及一些免疫性疾病.生物学上,应用于基因功能的研究,作为转基因的载体,动物模型的建立及癌症的研究等.该文就AAV的基本生物学特性和应用进展进行综述.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2016(022)011【总页数】5页(P2088-2092)【关键词】腺相关病毒;载体;血清型【作者】石亮【作者单位】中国医学科学院医学实验动物研究所,北京100021【正文语种】中文【中图分类】Q782腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为一种理想的基因载体，利用病毒对细胞的感染能力，将携带的外源基因转移到细胞中，效率大大高于非病毒载体系统。
因此，人们利用AAV进行基因治疗，基因过表达，基因沉默等。
其最大的特点是不但能感染分裂期的细胞而且还能感染非分裂期的细胞，在体内长期表达存在，没有致病性。
现就AAV的基本生物学特性及其应用进展进行概述。
AAV属于细小病毒科，无包膜，正二十面体，直径20～26 nm,基因组大小为4.7 kb的单链DNA[1]。
AAV本身为复制缺陷病毒，只有在辅助病毒(腺病毒、疱疹病毒等)作用下才能复制增殖[2]。
它有两个开放的阅读框，末端重复序列位于开放阅读框的两侧。
左侧rep基因编码四个非结构性蛋白，对病毒的包装和复制起重要作用。
右侧的cap基因编码三个结构蛋白，负责病毒颗粒的整合、复制和装配。
AAV不但能感染分裂细胞也能感染非分裂细胞，在体内具有广泛的组织转导性包括心脏、肝脏[3]、肺[4]、骨骼肌、大脑、眼睛等[5-6]。
其具有长期高效的表达，无致病性，低免疫性等优良特征。
华人学者高光坪Nature子刊发文，详述基因治疗明星载体腺相关病毒（AAV）丨医麦猛爆料
华人学者高光坪Nature子刊发文，详述基因治疗明星载体腺相关病毒（AAV）丨医麦猛爆料2019年2月15日/医麦客 eMedClub/--近日，权威期刊Nature Reviews Drug Discovery针对“腺相关病毒(AAV)载体作为基因治疗递送的平台”展开讨论，其中通讯作者为国际基因治疗领域著名专家、美国基因与细胞学会当选主席高光坪教授，同时他也是Voyager Therapeutics的创始人之一。
腺病毒相关病毒(AAV)最早是在20世纪60年代中期从实验室腺病毒(AdV)制剂中发现的，并且很快就在人体组织中发现。
在纯科学的好奇心驱使下，一些研究小组开始了解基本AAV生物学的过程，此时并没有意识到其作为人类基因治疗平台的巨大潜力。
在AAV研究的前15-20年中，AAV的几个重要方面被表征，包括其基因组构型和组成、DNA复制和转录、感染潜伏期和病毒粒子组装。
这些成果共同促进了野生型AAV2序列成功克隆到质粒中，从而实现了基因研究和整个AAV2基因组测序。
早期研究提供了使用AAV作为基因传递载体的基础知识。
50年AAV时间线（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）现如今，重组AAV(rAAV)已经成为体内基因治疗递送的主要平台。
第一种rAAV基因治疗产品是uniQure公司的alipogene tiparvovec(Glybera)，于2012年被欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症；2018年，FDA批准了voretigene neparvovec-rzyl(Luxturna)，这是第一个获得美国许可的rAAV基因疗法。
作为病毒AAV属于细小病毒科，Dependoparvovirus属。
它的生命周期依赖于辅助病毒的存在，例如AdV。
AAV存在于多种脊椎动物中，包括人类和非人类灵长类动物(NHP)。
目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。
腺相关病毒基因疗法值得深思
腺相关病毒基因疗法值得深思■文/徐京龙随着对腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）基因组和生物学特性的深入研究，研究人员基于AAV 研制出了重组腺相关病毒（rAAV）药物，并应用于治疗基因缺陷疾病，使得之前认为无法治愈的遗传性基因缺陷疾病和病毒感染性疾病有了治愈的可能。
这种治疗方法也代表了目前先进的医学方法。
截至2018年12月底，已有145项运用rAAV 的临床试验，其中有两项疗法被美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市。
然而，这个被认为有远景的基因治疗载体背后存在潜在的风险。
宿主免疫反应虽然AAV 颗粒直径小，免疫原性较低，但是在临床研究中发现rAAV 蛋白衣壳、基因组、外源基因蛋白产物在多个阶段会与机体免疫系统相互作用，降低基因治疗的疗效。
此外，在大部分人群的血液循环中能够发现AAV 的中和性抗体可以阻断rAAV 的递送。
因此，对中和性抗体的筛查是临床研究的必要步骤。
rAAV 蛋白衣壳能够触发T 细胞介导的细胞毒性效应，导致靶细胞被清除，治疗效果丧失。
研究人员通常使用类固醇药物对CD8+ T 细胞进行抑制，确保外源基因在靶组织的长期表达。
外源基因编码的蛋白可导致机体产生对应的抗体，降低治疗效果。
因此，需要对外源基因产生的抗体进行检测，保证外源基因产物的疗效。
此外，rAAV 蛋白衣壳和基因组还可能引起Toll 样受体2（TLR2）的先天性免疫反应，这种反应会产生促炎细胞因子，激活适应性免疫反应。
目前，对应的策略是在rAAV 基因组中插入TLR2抑制性DNA 序列从而逃避先天性免疫的监视。
整合于宿主基因组AAV 在宿主基因组的整合一直是基因治疗领域备受争议的问题。
2020年1月6日，国际期刊《科学》（Science ）发表了一篇关于在大型成年狗体内开展rAAV 治疗A 型血友病的研究论文。
研究人员发现在经rAAV 治疗的9只狗中，2只狗的凝血因子VIII 的表达水平在接受治疗后的几年仍在上升，整体呈现良好态势。
六型重组腺相关病毒(rAAV6)高效并优先感染星形胶质细胞的体内外研究
六型重组腺相关病毒（rAAV6）高效并优先感染星形胶质细胞的体内外研究腺相关病毒载体是越来越受欢迎的载体工具，它可将基因输送到中枢神经系统，具有非致病性、免疫原性低、可感染分裂细胞和非分裂细胞的特点。
它的一个局限性是对神经类细胞的感染有取向性，神经胶质细胞特别是星形胶质细胞的感染效率很低。
为了克服这个局限，先前的研究中利用星形胶质细胞的特异性的启动子来构建载体包装病毒，以及用不同血清型的病毒来感染星形胶质细胞，但是各种研究中的感染效率并不一致。
在本实验中，我们测试了7种商业化的腺相关病毒的血清型，血清型1、2、5、6、7、8、9（腺相关病毒由维真生物提供），通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达来测试各种血清型病毒感染星形胶质细胞的能力。
在细胞培养中，rAAV6表现出稳定的高效的感染效率，而rAAV2只有一些批次的病毒对星形胶质细胞有感染性。
为了证明我们所用的病毒活性没有问题，我们将所用病毒感染公认的易感染细胞ARPE-19细胞并都表现出很高的感染性。
基于体外实验结果，我们选用rAAV6和rAAV2进行了体内实验，同样条件下感染星形胶质细胞和神经元细胞，感染3个星期后，对病毒表达蛋白GFP、神经元细胞特异性标志蛋白NeuN以及星形胶质细胞特异性标志蛋白GFAP进行免疫染色，我们发现rAAV6对星形胶质细胞有很高的感染率（90%以上细胞被感染），但是对神经元细胞的感染率很低（约10%感染率），相反地，rAAV2对神经元细胞有高感染率（约65%），但是不易感染星形胶质细胞（约20%）。
总之，我们的研究表明rAAV6能够被用作对体内星形胶质细胞进行基因表达调控（过表达或敲低）的工具。
病毒载体在中枢神经系统中广泛用于基因递送和目的基因的表达。
其中，腺相关病毒（AAV）已越来越受欢迎，它具有以下优势：非致病性，低免疫性，能有效转导分裂细胞和非分裂细胞，并能产生持久的基因表达。
AAV载体在基础研究中的成功使其应用于临床实践中，包括在中枢神经系统中的应用。
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rAAV的应用-骨骼肌细胞感染
AAV-lacZ注射肌细胞，原位杂交检测病毒的表达量（Kessler PD et al. PNAS. 1996.）
rAAV的应用-肺部细胞的感染
在CMV和RSV启动子调控下AP在肺部的表达 情况（Halbert CL et al. Hum Gene Ther. 2007.）
rAAV的应用-神经元投射研究
rAAV注射红核区，分别在7 d和30 d观察转 导效率和感染RN细胞的特异性（Blits B et al. J Neurosci Methods. 2010.）
rAAV的应用-心脏心肌细胞的感染
不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌 细胞（Prasad KM et al. Gene Therapy. 2011.）
>2个月 6 kb 一般 10^8-9 vg/mL 70%
AAV载体的优势与局限
• 优势
– 安全性高
• 无致病性、不整合、低 免疫原性
• 局限
– 外源基因容载能力有限
• ＜4.7 Kb
– 表达时程长
• ＞5个月高效稳定表达
– 通用启动子高表达外源 基因的毒性
– 嗜性广
• 分裂及非分裂细胞（神 经元）、多种血清型实 现不同靶向
rAAV在肝脏纤维化研究中的应用
rAAVX-EYFP感染肌成纤维细胞效 果图（Rezvani M et al. Cell Stem Cell. 2016.）
rAAV的应用-脑中枢神经元的感染
rAAV-GFP注射海马感染效果图（Broekman ML et al. Neuroscience. 2006.）
rAAV的应用-神经示踪
图a.利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背外侧被盖区（LDT）中PV阳性和SOM阳性中间神经元的直 接调控网络示意图；图b. LDT中PV阳性和SOM阳性中间神经元都接受来自外侧僵核（LHb）的直 接调控(Yang H et al. Nat Neurosci. 2016.）
rAAV的应用-神经示踪
AAV病毒颗粒示意图；B：AAV病毒基因组结构（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）
病毒载体选择指南
Adenovirus 基因组 包膜 dsDNA 无 Adeno-associated Virus (AAV) ssDNA 无 Lentivirus ssRNA (+) 有
重组腺相关病毒rAAV
中科院神经所病毒平台 2017年1月
腺相关病毒（rAAV）简介
• 腺相关病毒、细小病毒科
• 无包膜单链DNA病毒，基因组长约4.7-6 kb
• 是迄今发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，通常需要 在辅助病毒的辅助下才能发生产毒性感染，生成子代AAV
AAV的基因组及其编码的蛋 白
基因组大小 细胞感染 整合机制
持续时间 包装能力 免疫原性 滴度 转导效率
38-39 kb 分裂细胞和非分裂细胞 非整合
<10天 7.5 kb 强 10^11-12 vg/mL 100%
5 kb 分裂细胞和非分裂细胞 定向整合
>3个月 4.5 kb 弱 10^12-13 vg/mL 70%
9 kb 分裂细胞和非分裂细胞 整合
纯化后的rAAV病毒经过扫描电镜检测，完整 的rAAV颗粒比例大于85%， 病毒质量高。
纯化后的rAAV处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测， 可以观察到明显的病毒粒子衣壳蛋白VP1，VP2，VP3所对应的 1:1:10 比例组成的三种蛋白，分子量与预期一致，纯度高于95%。
AAV的血清型与其对细胞组织的转导特 性
• 病毒质量不稳定
– 多批次包装条件不均一 – 纯化过程导致的空壳率不可控
新型rAAV杆状病毒制备系统
杆状病毒系统制备rAAV的流程图
新型AAV杆状病毒制备体系的优势
灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，rAAV纯化 后能够达到很高的纯度，可有效解决非人灵长类动物神经环路标记的大量需求。
利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨单突触 系统研究杏仁核基底外侧核后部至腹
侧海马CA1区之间存在丰富的谷氨酸
能兴奋性单突触输入（Yang Y et al. Nat Commun. 20：rAAV载体原理（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）；
B：制备rAAV的三质粒系统示意图（Ayuso E et al. Curr Gene Ther. 2010.）
传统三质粒制备AAV系统的缺陷
• 生产能力低
– 103-104vg/cel – 难满足灵长类研究及临床需求
• 不同血清型AAV对小鼠组织细胞的嗜性差异很大（Karen Kozarsky et al. Nat Methods. 2010.）
rAAV的应用-视网膜内界膜细胞的感染
在内界膜注射 rAAV2-CBA-GFP，病毒感染 效果图。A：在注射部位，大部分的视网膜 神经细胞病毒表达水平都很高 ；B: 视网膜 muller细胞和双极细胞均检测到信号 （Boye SE et al. Hum Gene Ther. 2016）