新型鸭病毒性肝炎病毒

(2)P3非结构蛋白: P3区编码4种非结构蛋白，分别是3A ,3B ,3C和3D。 据报道，小RNA病毒科的病毒,3A蛋白与病毒毒力有关。 3BVPg蛋白包含34个as，这在小RNA病毒中是最大的3B蛋 白，并且与其他小RNA病毒的3B蛋白序列一致性很低， DHV的L(亮氨酸)被小RNA病毒KP基序中的K(赖氨酸)所取 代，但是该蛋白第3位酪氨酸Tyr (Y)残基却很保守，它在 VPg与基因组5’末端尿嘧啶的附着过程中起重要作用。 DHV的3C蛋白酶是催化裂解小RNA病毒多聚蛋白中非结 构蛋白部分的关键酶，具有丝氨酸蛋白酶和半肤氨酸蛋白 酶双重特性，病毒编码的3C蛋白酶完成多聚蛋白的大多数 切割，通常发生在谷氨酞胺和甘氨酸之间的肤键( Gln-Gly ) ,最终产生11个终末产物。DHV的3D蛋白是依赖RNA的 RNA聚合酶( RNA-dependent RNA polymerase),3D蛋白在病 毒RNA复制中起主导转录及复制作用。
(1)VPl基因: 小RNA病毒中VP1蛋白作为主要的宿主保护蛋 白，具有特异性抗原中和位点，VP1蛋白多暴露 于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，它 能够诱导动物产生中和抗体。I型DHV与其他小 RNA病毒之间衣壳蛋白的氨基酸序列差异主要存 在于VP1的两端。何内娅通过对华南地区分离到 的I型和新型DHV的VP1氨基酸序列比对分析表明 :VP1包括了大部分的插入与缺失片段和高变异区 ，高变区主要分布在46 -64,95-149,180-223位，尤 其是C末端，存在点突变或连续变异。在第145146位，15株新型DHV毒株比3株I型DHV多2个氨 基酸(G和G)。I型DHV和新型DHV的VP1蛋白不存 在小RNA病毒科保守的RG D基序((Arg-GlyAsp(RGD)) ,而I型DHV相应序列为SGD，而新型 DHV为QSD，这表明DHV的病毒吸机制和复制能 力存在差异还有待于进一研究。
I型DHV的IRES己报道具有8个茎环结构， 3’UTR内含有病毒RNA复制和翻译有关的poly(A) 尾。I型DHV的3’UTR为314 nt，新型DHV的 3’UTR为366 nt，均具有典型的小RNA病毒的基因 组结构、,I型DHV多聚蛋白具有11个切割位点， 且具有与小RNA病毒相似的切割位点和保守基因 序列。基因组编码区包含结构蛋白和非结构蛋白 ，分为3种初级前体分子P1,P2,P3,其中，P1前体蛋 白裂解为组成病毒衣壳蛋白VP0,VP3和VP1，3种 结构蛋白。P2和P3构成病毒的非结构蛋白。P2编 码2A1,2A2,2A3,2B和2C 3种非结构蛋白，P3编码 3A,3B,3C和3D 4种非结构蛋白。
2.2 编码区
DHV包含一个大的ORF，编码一个多聚蛋白， 多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶 水解，从而分解成P1、P2和P3产物，P1、P2和P3 又进一步分别分解为VP0 -VP3 -VP1-2A1-2A2-2B2C-3A-3B-3C-3D、I型DHV的多聚蛋白的切割位 点预测的结果是:VP0/VP3和3C/3D的切割位点为 ：Q/G;2A3/2B,2B/2C ,2C/3A,3A/ 3B以及3B/ 3C的 切割位点为Q/S；VP3/VP1的切割位点为Q/M。多 聚蛋白水解产生的多肤数量主要由以下因素决定: (1)基因组是否存在L蛋白。 (2)VP0是否水解为VP4和VP2。 (3)2A蛋白的数量。其也是小RNA病毒的基因组在 不同的种属之间存在的差异所在。
小RNA病毒的基因组在不同的种属间虽然存在 差异，但是在病毒复制过程中具有相似的功能、 ,L蛋白作为前导蛋白;2A是蛋白酶，参与多聚蛋白 早期切割和宿主蛋白的合成关闭;2B蛋白作为宿主 范围的决定因子;2C蛋白是小RNA病毒中的保守序 列，与病毒RNA合成相关;3A蛋白与病毒毒力有关 ;3B蛋白即VPg，是共价结合于正链和负链RNA 5’ 末端的蛋白引物;3C蛋白构成大部分多聚蛋白，3C 蛋白在病毒加工处理过程和RNA复制中产生，具 有水解多聚蛋白活性，并且具有一个半胱氨酸作 为亲核作用的活性位点.3D蛋白是RNA依赖的 RNA聚合酶。
2.新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检 测方法的建立及应用
近年来，DVH在世界各地不断发生，其发病率和死亡 率均呈上升趋势，养鸭比较集中的地区均遭受了巨大的经 济损失和严重的威胁，由于新型鸭病毒性肝炎病毒(NDHV)的存在，许多地区频频出现I型鸭病毒性肝炎病毒 (DHV- I)免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道，严重制约了养鸭业 的发展，不少学者己从发病鸭群中分离到工型鸭肝炎病毒 的变异株(新型毒株,N-DHV),2007年，有学者先后证实新 型DHV也具有典型的DHV I基因组结构，但其与DHV -I在 序列上存在显著差异，且新型DHV均不与DHV- I产生交叉 反应。因此，加强N-DHV病原诊断技术的研究对预防和控 制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。本试验选取新型 DHV与传统工型DHV差异序列区设计引物，建立了NDHV检测的逆转录巢式PCR方法，旨在为新型鸭病毒性肝 炎的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物 学检测方法。
2.1 非编码区
I型DHV基因组5‘UTR长626 nt ,内含病毒翻译起 始所必需的内部核糖体进入位点(IRES)。在各病 毒属不同血清型之间，小RNA病毒IRES元件的序 列和二级结构具有保守性，是病毒存活所必需的 。小RNA病毒的IRES分为3个型，I型IRES的病毒 包括肠道病毒属和鼻病毒属，心脏病毒属、口疮 病毒属，双埃柯病毒属的IRES属于II型IRES;甲肝 病毒属的IRES属于III型IRES。通过对I型DHV的 RNA级结构预测表明，I型DHV的5’UTR可能含有 II型IRES的颈环结构而没有I型的三叶草结构，
2.1 材料和方法
• 2. 1.1 病毒 N-DHV、DHV-Ⅰ、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、 鸭细小病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV )、传染性 法氏囊病毒(IBDV)均由本实验室分离并保存。 • 2.1.2主要试剂 Trizol、M-MLV反转录酶、Ribonuclease Inhibitor购自生工生物工程(上海)有限公司;Ex Taq 酶、pMD18-T克隆载体及其他限制性内切酶均购 自宝生物工程(大连)有限公司;质粒DNA提取试剂 盒与胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限 公司。
据此推断I型DHV的5’UTR区域会形成II型的IRES I型DHV的3’UTR长为314-317nt，新型DHV长366nt ，这在小RNA病毒基因组中是最长的。有学者报 道,I型DHV的3’UTR形成了5个发夹结构，参与病 毒的复制，但它是否与宿主特异性有关还需进一 步研究。病毒的3’端poly(A)尾作为病毒RNA的负 链合成起始位点，其长度与负链RNA的合成效率 及病毒RNA的感染能力有关。
(2)VP3基因: VP3蛋白的N末端具有免疫原性，VP3的N端以 及连接β链的环，特别是βB-C,βE-F及βG-H环的序 列差异显著、何内娅通过对华南地区分离到的I型 和新型DHV与参考毒株进行VP3基因的变异分析 ，结果显示，I型DHV和新型DHV的VP3基因不同 点在于:第三位I型(R) →新型(K)，第15位I型(N) → 新型(S)(除了台湾新型)，第20位I型(P)→新型(S) ，第22位I型(V) →新型(I)，第39,40位I型(IA) →新 型(VT)，第45、69位I型(T,I) →新型(A/V , V)，第 78位～第107位为I型和新型DHV变异最多处，第 125,126位I型(MT) →新型(LL)，第143到第234位I 型和新型DHV存在不连续的多位点不同，这些变 异区是否影响I型和新型DHV的致病机理有待于进 一步研究。
1.1 DHV的历史与分布
鸭肝炎病毒(DHV)包括三个血清型，分别引起Ⅰ型, Ⅱ
型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎。其中Ⅰ型鸭病毒性肝炎呈世界性 分布。我国流行的鸭病毒性肝炎主要为Ⅰ型鸭病毒性肝炎 ，近年来陆续有新型鸭病毒性肝炎发现三个型之间无抗原 相关性，没有交叉保护和交叉中和作用。DHV最早发现是 在1945年由Levine在美国发现了Ⅰ型鸭病毒性肝炎。该病 呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法国、日本、美国 和埃及等地流行、在我国广东、北京、浙江、福建、四川 、安徽、广西、江苏、山东等地相继发生该病、目前几乎 世界范围内主要养鸭地区均存在该病，给养鸭业带来了巨 大的经济损失。
• 2.2.2非结构蛋白:
(1)P2非结构蛋白:
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小RNA病毒中，P2区长2271nt,I型DHV推测具 有多达3种不同的2A蛋白，分别是2A1 ,2A2和2A3 以及2B,2C。DHV的2A2蛋白是小RNA病毒多聚蛋白 中的1个新蛋白，由161aa组成，可能参与病毒与 宿主细胞之间相互作用，推测与病毒复制有关。 2A3蛋白由124aa组成，含有3个结构域。2A3蛋白 可能在控制细胞生长方面起作用，目前关于小RNA 病毒2B和2C蛋白的具体功能还不清楚。
• 2.2.1结构蛋白: P1区编码病毒的壳体蛋白，包括VP0,VP3,VP1 基因，核苷酸序列全长2193 nt、 I型DHV VP0的N 末端缺少GxxxS/T基因序列，因此其N末端可能未 被十四烷基化，VP0不被蛋白酶切割为VP2和VP4 。试验证明，壳体蛋白含有多个类似于其他小 RNA病毒的核心结构，即八链反向平行β桶结构， 与其相连的环形结构位于壳粒表面，这在免疫学 中占有重要作用。I型DHV的VP3与人肠道病毒 (Humanparechovirus, HPeV)一样，N一末端有一段 残基丰富区延伸出来，长度约20aa,这段区域在 HPeV中具有很强的免疫原性但它在I型DHV是否 也具有同样的功能还未见报道。
Ⅱ型鸭病毒性肝炎是1958年首先爆发于英格兰诺福克鸭场 ，其他地区未见本病的报道。Ⅲ型鸭病毒性肝炎是1969年 首次发现于美国纽约长岛地区。1999年，苏敬良等和黄安 国等在北京和广西等地在3～13日龄疑似鸭肝炎的北京鸭和 樱桃谷鸭上分离到两株与I型和III型DHV无血清学交叉免疫 反应的DHV，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型 鸭肝炎病毒。新型鸭病毒性肝炎的基因组与I型结构相似， 但比I型DHV基因组稍大。同时，发现高变区主要存在于VP1 和VP3基因、在VP1,VP3基因上存在多个T细胞抗原表位和B 细胞抗原表位，VP1基因的变异致使不同血清型DHV抗原性 发生改变。
新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测 方法的建立及应用
报告人：王梓
1.鸭病毒性肝炎
鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭
病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)引起雏
鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致
死性、接触性传染性疾病。鸭病毒性肝炎在临床 上以发病急、传播迅速、病程短、高死亡率为主 要特征，该病主要侵害4周龄以内的雏鸭,10口龄 以内的雏鸭的死亡率高达90%~95%。
1.2 DHV的生物学特征
2006年Kim M C报道了I型DHV的全基因组序列，2007 年Tseng C H报道了DHV-1型变异株全基因组序列，为 DHV的研究做出了新的突破。DHV与其他小RNA病毒相 比，DHV基因组具有一些特殊的结构特征,TsengC H等建 议将I型DHV归为小RNA病毒科一个新的独立的属。T.Yun 等构建出了具有感染性的DHV全长cDNA克隆，为进一步 揭示DHV基因组的结构和功能及防控该病提供了良好的技 术平台。I型DHV基因组大小约为7,690nt,编码2,249aa、具 有一个较大的开放阅读框(ORF)，在基因组RNA两端各有 一段保守的非编码区,I型DHV全基因组结构依次为 :5'UTR(626nt)-VPO-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C3D-3'UTR (314nt),5'UTR内含有病毒翻译起始所必需的内 部核糖体进入位点(IRES)