Caco-2细胞转运实验详细讲解
Caco-2细胞转运实验详细讲解
Caco-2细胞转运实验详细讲解
Caco-2 细胞转运实验
⼈结肠癌细胞系Caco-2是⽤来研究药物经肠吸收的常⽤模型。
Caco-2细胞体外培养条件下可⾃发进⾏上⽪样分化，形成与⼩肠上⽪细胞相同的微绒⽑结构和紧密连接，形态学、标志酶的功能表达及渗透特征都与⼩肠柱状上⽪细胞很相似。
在Caco-2细胞中，主要药物转运体如寡肽转运体PEPTI,P-糖蛋⽩MDRI、多药耐药相关转运蛋⽩MRP2和有机阴离⼦转运多肽OATP2B1均有较⾼⽔平表达，能够快速得到药物的跨膜转运属性。
此外，Caco-2细胞还表达⼀些肠道常见的糖苷酶、氨肽酶、酯酶和代谢酶，可考察存在代谢的情况下药物的转运情况。
由Caco-2细胞获得的药物表观渗透系数（Papp）与⼈⼩肠吸收具有良好的相关性，作为药物吸收研究的⼀种快速筛选⼯具，Caco-2细胞模型已⼴泛⽤于体外药物分⼦⼩肠吸收的研究。
Caco-2细胞模型是将Caco-2细胞接种于半透膜（多为聚碳酸酯多孔膜）上，待细胞⽣长分化为完整的细胞单层（⼀般21～24天），即可模拟⼈体肠道上⽪吸收屏障，⽤于药物通透性实验（图11-5）。
近来研究发现，⽝肾上⽪细胞系MDCK Ⅱ和Caco-2细胞在许多药物的转运上具有很好的相关性，且其培养周期较短(3～5天）即可形成完整细胞单层，可以作为⼀种改良的Caco-2细胞模型，进⾏药物的经肠吸收研究（图11-6）。
Caco-2 细胞模型的研究与应用
的波动性对结果有不同程度的影响。
Caco－2 细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具 特征性,其TEER 值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分 子药物穿细胞间转运的应用研究。 Caco－2 细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低,因而在主动转 运药物的研究方面相对不如被动扩散药物研究的成功。
该模型有较广泛的适用性(可用于原料药、制剂、大、小分子
的跨肠膜研究)。 Caco-2 细胞内有药物代谢酶,可在有代谢状况下测定药物的跨 膜转运。 可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。
Caco－2 细胞单层模型的缺点
Caco－2细胞由于缺乏分泌粘液的杯状细胞,因而缺乏小肠上皮中 的粘液层。
缺少细胞异质性(单一细胞构成) ;
0.1×10 – 6~1.0×10 – 6
< 1 ×10 - 7
研究药物剂型对吸收的影响[4] 确定药物在肠腔吸收的最适pH 值[5] 评价前体药物的口服吸收[6]
Caco－2 细胞单层模型在药物吸收机制研究中的应用
Caco-2 细胞模型用于被动转运的研究[7] Caco-2 细胞模型用于载体介导主动转运的研究[8、9]
SeminarⅠ
Caco-2细胞模型的研究与应用
主要内容
Caco-2细胞的介绍 Caco-2细胞模型的建立与评价
Caco-2细胞模型的应用 Caco-2细胞模型的发展
Caco－2 细胞单层模型简介
Ｃaco-2细胞： 人结肠癌细胞（the human colon carcinoma cell line)
Tab 1 Relationship between apparent permeability coefficients( Papp) and Bioavailability
caco2读法
caco2读法Caco2，全称为Caco-2细胞模型，是一种常用的肠道吸收模型。
它是从人体结肠癌细胞分离出来的细胞株，具备相似的特性和功能。
Caco2细胞可用于评估药物的肠道吸收、预测生物利用度以及研究药物和营养物质的通过肠道的动力学。
本文将介绍Caco2细胞模型的基本原理以及其读法的相关内容。
一、Caco2细胞模型简介Caco2细胞模型最早在20世纪80年代被开发出来，由于其可靠的预测性和便捷的操作性，成为了药物吸收研究领域中最常用的细胞模型之一。
Caco2细胞模型可模拟人体肠道上皮层的结构和功能，因此被广泛应用于药物的吸收、转运和代谢方面的研究。
二、Caco2细胞模型的原理Caco2细胞模型的原理基于细胞外和细胞内物质的通过细胞膜的过程。
药物在通过Caco2细胞层时需经历细胞外和细胞内的转运，包括主动转运、被动扩散和内膜转运等过程。
这些转运机制模拟了真实的肠道吸收情况，因此Caco2细胞模型可用于预测药物在体内的吸收情况。
三、Caco2细胞模型的读法1. 细胞培养Caco2细胞的培养是建立Caco2细胞模型的首要步骤。
首先需要将Caco2细胞分散在培养基中，然后将细胞培养在合适的培养皿中。
培养皿需要提供适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和气体环境等。
在培养过程中，需要定期更换培养基、控制细胞密度和检测细胞的生长状态。
2. 输送实验Caco2细胞模型的读法主要通过传递实验来实现。
传递实验可以分为两种类型：顶部对顶部和底部对顶部。
顶部对顶部传递实验主要用于研究药物的主动转运和被动扩散，而底部对顶部传递实验则可用于研究药物的内膜转运和代谢。
3. 可溶性和稳定性研究为了评估药物的可溶性和稳定性，需要对药物在Caco2细胞模型中的溶解度和稳定性进行研究。
一种常用的方法是测定药物在不同pH值下的溶解度，并通过液相色谱-质谱分析来确定药物在Caco2细胞模型中的稳定性。
四、Caco2细胞模型的应用Caco2细胞模型广泛应用于药物吸收、转运和代谢等领域的研究。
想研究药物口服吸收？Caco-2细胞模型来帮你
想研究药物口服吸收？Caco-2细胞模型来帮你作者：叶军（转载请注：解螺旋·医生科研助手）Caco-2细胞转运模型是首个被国外制药企业以及实验室应用的模拟肠道吸收的药物筛选模型，已广泛应用于药物在小肠吸收的评价和转运机制研究中。
Caco-2细胞的结构和功能类似于人小肠上皮细胞，含有与小肠刷状边缘上皮相关的酶系。
与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现的逆向分化不同，Caco-2细胞在多孔可渗透的聚碳酸酯膜上培养3周后可以自发分化为肠上皮细胞，形成致密的细胞单层，进而可用作肠道转运模型（图1）。
Caco-2细胞模型培养和验证方法简单，与体内动物实验相比更为方便、经济。
1. Caco-2细胞培养1) 采用MEM完全培养液（含10%胎牛血清、1%非必须氨基酸、1%丙酮酸钠、1%谷氨酰胺和1%青-链霉素）在37℃和5% CO2条件下培养Caco-2细胞；2)每隔一天更换一次培养液。
当细胞汇合程度达80%时，进行细胞传代。
将细胞培养液吸出，用不含Ca2+和Mg2+离子的HBSS小心清洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混合消化液进行消化；3)取细胞适量接种到75 cm2培养瓶继续培养或进行铺板操作。
2. Caco-2细胞模型的构建及验证1)收集对数期的Caco-2细胞，用MEM完全培养液将细胞浓度调整为2.0×105 cells/mL；2)在Transwell板（聚碳酸酯膜，0.4 µm，1.12 cm2）（图2）的基底侧（Basolateral side）加入1.5 mLMEM完全培养液，在顶侧（Apical side）加入细胞悬液0.5 mL；3)放入细胞培养箱内培养，每两天换一次培养液，培养一周后每日换液；4)继续培养至21天；5)采用Millicell ERS电阻仪（Millipore公司）测定跨上皮细胞电阻（大于500 Ω·cm2），确定细胞单层的致密性和完整性。
22222Caco_2细胞模型及其在药物吸收研究中的应用新进展_王敏
TEER值 (跨膜电阻值 )较单用 Caco22细胞有所降低 ,而且水 溶性小分子物质经共培养细胞模型的渗透能力高于单纯的 Caco22细胞模型 ,有利于水溶性小分子物质细胞转运过程的 研究 。
由于 Caco22细胞缺少某些首过代谢酶 ,而这些酶是影响 药物口服吸收和生物利用度的关键酶 , Charles等 [3 ]利用重 组技 术 在 Caco22 细 胞 中 引 入 CYP cDNA s, 从 而 提 高 了 CYP3A4和 CYP2A6的表达 ,开拓了 Caco22模型在研究药物 首过代谢方面的应用 ,提高了其体内相关性 。由于 Caco22细 胞缺少或低表达小肠上皮细胞内的某些药物代谢酶和转运 体 ,因此 ,有人采用经典的细胞生物学方法诱导药物代谢酶 的表达 ,结果发现 ,在各种酶诱导剂如苯巴比妥 、地塞米松 、 β2萘黄酮存在下培养 Caco22细胞的亚克隆细胞 ,可诱导表达 不同的酶系统 [4 ] 。如 Caco22细胞的亚克隆 TC7细胞经诱导 后可增加 CYP3A的表达 ,且高表达与刷状缘相关的水解酶 、 蔗糖 2麦芽糖异构酶 ,以及牛磺胆酸转运系统 ;经 β2萘黄酮诱 导可表达 CYP1A1 基因亚家族 ,以及高活性的 UPD 2葡萄糖 醛酸转移酶 。这些性质使 TC7细胞成为有价值的体外肠道 研究模型 。另外 ,有研究发现 , Caco22细胞在多孔膜上与 100 nmol·L - 1 1α, 252二羟维生素 D3共培养 2周后可诱导 Caco22 细胞内 CYP3A4 mRNA 的表达 ,与重组技术一样也能形成一 个用以研究药物小肠吸收首过效应的细胞模型 [5 ] 。 2 Ca co22 细胞模型在口服药物吸收改善研究中的应用 211 Caco22细胞模型在各种药物吸收促进剂开发研究中的 应用 21111 应用于细胞旁路转运药物吸收促进剂的研究 亲水 性药物及多肽类药物往往表现出低的口服生物利用度 ,一个 重要原因就是肠上皮细胞的紧密连接使得这些药物经细胞 旁路的被动扩散受到限制 。最近几年 ,研究者们致力于开发 能够调节肠上皮细胞紧密连接 (但不破坏细胞单层完整性 )
Caco-2 细胞模型的研究与应用(课堂PPT)
微绒毛 紧密连接
细胞核
3
Caco－2 细胞单层模型简介
Caco-2细胞生化性质特征： 主动转运系统:糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B12内源性 因子的主动转运载体。 酶: 小肠细胞刷状缘的酶； Ⅰ相代谢酶:CYP1A1 Ⅱ相代谢酶:谷胱甘肽S-转移酶,β-葡萄糖醛酸糖苷酶及 磺基转移酶。
14
Caco-2 细胞模型在药物代谢方面的应用
I相代谢酶:细胞色素P450等。
Ⅱ相代谢酶:磺基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶、β-葡糖
醛酸糖苷酶。
存在P-gp 、MRP 外排系统及细胞色素P450 同工酶(与
人
类小肠口服生物利用度方面的关系[12]
SeminarⅠ
Caco-2细胞模型的研究与应用
1
主要内容
Caco-2细胞的介绍 Caco-2细胞模型的建立与评价 Caco-2细胞模型的应用 Caco-2细胞模型的发展
2
Caco－2 细胞单层模型简介
➢Ｃaco-2细胞： 人结肠癌细胞（the human colon carcinoma cell line)
活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gp 在Caco-2 细胞中表达
的波动性对结果有不同程度的影响。
❖Caco－2 细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具
特征性,其TEER 值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分
子药物穿细胞间转运的应用研究。
❖Caco－2 细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低,因而在主动转
。
15
Caco－2 细胞单层模型的优点
❖细胞培养条件相对容易控制, 能够简便、快速的获得大量新 的、有价值的信息, 这些信息易于转化为药物转运、代谢的 基本原理。
Caco2 细胞
Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。
可以用来进行模拟体内肠转运的实验。
在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。
细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。
胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似。
作用：1. 研究药物吸收的潜力2. 研究药物转运的机制，包括吸收机制和排除机制3. 研究药物、营养物质、植物性成分的肠道代谢判断药物吸收能力的方法：Papp（表观渗透系数）Papp>2*10-6属于吸收好的药物如Testosterone(睾酮):1.0*10-5cm/s Propranolol（普奈洛尔）:2.86*10-5cm/sPapp<10-6cm/s属于吸收差的药物如Mannitol(甘露醇):1.0*10-7 cm/s Atenolol（阿替洛尔）:4.55*10-7 cm/s现代药物研发成功与否，与药物的代谢特性密切相关。
人工合成和筛选有限数量的化合物已被大规模的化合物合成和高通量筛选所取代。
无论是开发新药还是开发新的给药途径，化合物在体内的吸收特性都非常重要。
以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，因而开发新的快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。
被广泛采用的三种筛选方法是：大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及体外人结肠腺癌（Caco-2）细胞系法。
其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。
结构与功能决定其应用价值Caco-2细胞模型是十几年来国外广泛采用的一种研究药物小肠吸收的体外模型，具有相对简单、重复性较好、应用范围较广的特点。
caco细胞transwell接板
caco-2细胞单层模型的评价：①细胞形态学(小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接) ;②小肠刷状缘细胞标志酶———碱性磷酸酶的活性;③Caco－2 细胞单层的跨膜电阻( transepithelial electrical resistance ,TEER) ;④漏出标志物(甘露醇、荧光黄等) 被动扩散的跨膜通量;⑤Caco－2 细胞的胞饮功能(用辣根过氧化物酶测定)将Caco-2细胞至于常规培养皿内，以DMEM为培养基（含10%FBS），在37°C、5% CO2和相对湿度90 %的培养箱内培养，培养基隔天更换，4～5天达到融合。
当细胞覆盖盘底80%～90%时，用含0.25%EDTA的胰酶消化，并用新鲜培养基调整细胞密度至2 105/ ml接种于Transwell聚碳酸酯膜12孔板中，在细胞层顶端（apical side, AP）每孔加0.5 ml细胞悬液，基底端（basolateral side, BL）每孔加1.5 ml 新鲜培养基。
前两周每隔一天换液一次，以后每天换液，连续培养至21天，得到完全分化的细胞单层。
本实验所用Caco-2细胞代数为45～50代。
跨膜电阻值（TEER）提供跨细胞单层的离子流电阻信息，与细胞间紧密连接的完整性相关。
测定方法：首先将电极放入预热至37°C的HBSS中，平衡20分钟；移走培养板中的培养基，加入预热的HBSS，在AP侧每孔加0.5 ml，BL侧每孔加1.5 ml , 37°C平衡20分钟，同时洗去细胞表面的杂质；移走HBSS，重新加入预热的HBSS，测定跨膜电阻值值；用1个空白载体重复上述步骤以获得空白值；TEER=（测定电阻值—空白值）单层表面积（cm2）。
Caco-2细胞单层在12天后TEER值达到最大值， 21天后细胞分化完成，形成紧密单层，TEER为（450±15）Ω•cm2>350Ω•cm2；MDCK-Wild细胞单层在4天后TEER值达到最大值， TEER值为（240±12）Ω•cm2>150Ω•cm2；MDCK-MDR1细胞单层在4天后TEER值达到最大值，7天后细胞分化完成，形成紧密单层，TEER 值为（230±13）Ω•cm2>150Ω•cm2。
caco-2细胞膜模型实验概述
Caco-2细胞单层膜模型实验概述口服给药是最重要的给药方式之一，药物在肠道内的吸收速度及程度是影响药物生物利用度的重要因素。
药物的肠道吸收研究可以提供吸收机制、吸收部位及影响吸收的因素等重要信息，为药物的研发提供参考。
一、口服药常用的研究方法目前研究药物在肠道吸收的方法主要分为体内法（in vivo ）、在体法（in situ ）、体外法（in vitro ）。
3种研究方法适用不同的研究对象，应根据不同的研究需要进行选择。
1. 体内法 体内法是以整体动物机体为研究对象，进行药动学研究。
口服给药后，在不同时间点采集生物样本如血液、尿液，再通过一定方法测定其药物浓度，计算达峰时间（Tmax ）、达峰浓度（Cmax ）、药时曲线下面积（AUC ）等药动学参数，进而评价药物吸收的程度和速度。
此法采用整体动物进行实验，能真实地反映药物口服后的体内吸收情况，但是它综合了物化、生理、剂型等众多因素的结果，不能特异性地反映肠道对药物的吸收作用。
又由于实验周期长、操作相对繁琐、影响因素较多、动物个体差异较大等原因，故体内法很少应用于药物吸收机制的研究，一般用于研究药物体内药动学特征。
2. 在体法常用的在体法包括在体肠灌流法、肠襻法、肠道血管插管法等。
在体法是建立在整体动物水平上的实验，与体内法不同的是其将干扰因素大大减少，同时保证了肠道神经与内分泌调节的完整性，也保证了血液与淋巴液供应，使得待考察组织的生物活性大大提升，能够较为准确地反映药物在肠道的真实吸收情况，常用于研究药物的渗透和吸收动力学。
在体法由于是建立在整体水平之上，因此个体差异较大，对实验动物的数量有一定要求，以保证最小的数据变异。
3. 体外法常用的体外法主要有外翻肠囊法、组织流动室法、刷状缘膜囊泡法、细胞培养模型法等。
这些实验方法是基于分离部分肠黏膜或肠段，或是采用人肠细胞模拟肠环境评价药物吸收情况。
总的来说体外法优点在于操作简单、试验周期短，可以用于药物早期高通量筛选。
caco2细胞
Caco2细胞Caco2细胞是一种常用的人类结肠腺癌细胞系，常被用于研究细胞生物学、药物吸收和转运等方面。
这种细胞系源自结肠腺癌患者的转移灶，具有类似正常肠上皮细胞的形态和功能。
本文将介绍Caco2细胞的特点、应用和相关研究进展。
特点Caco2细胞是一种上皮细胞，呈长条状并呈多层排列。
这种细胞表面有微绒毛，类似于肠上皮细胞的微绒毛结构。
Caco2细胞还具有结肠腺癌细胞的特点，如易于培养、有相对稳定的倍增周期等。
应用Caco2细胞广泛用于研究药物在肠道的吸收和转运过程。
由于Caco2细胞具有肠上皮细胞的特点，因此可以模拟药物穿过肠道黏膜的生理过程。
科研人员可以在Caco2细胞培养基中添加不同浓度的药物，观察其在细胞内的转运和吸收情况，从而评估药物在体内的药代动力学。
此外，Caco2细胞还可以用于研究肠道疾病的发病机制，如炎症性肠病和肠道感染等。
通过模拟疾病条件，科研人员可以观察Caco2细胞的相应反应，探究疾病的发展过程。
研究进展近年来，随着细胞培养技术和细胞生物学研究的发展，Caco2细胞在药物研发、肠道疾病研究等领域发挥了重要作用。
研究人员通过基因编辑技术和高通量筛选技术，不断提高Caco2细胞的模拟能力和研究效率。
一些研究还表明，Caco2细胞可以应用于药物肠道黏膜递送系统、肠-肝循环等方面。
结论Caco2细胞作为一种常用的结肠腺癌细胞系，具有模拟肠道黏膜和疾病发生机制的能力。
在药物研发和肠道疾病研究中，Caco2细胞的应用将继续发挥重要作用。
未来，随着细胞生物学和疾病模型的不断改进，Caco2细胞的研究前景仍然广阔。
caco2细胞传代流程
caco2细胞传代流程
Caco-2细胞是一种人类肠道上皮细胞模型，常用于研究肠道吸收和转运的生理、药理特性。
Caco-2细胞的传代流程是指将一代细胞分裂培养并传递给下一代的过程。
传代是维持细胞株健康和稳定的重要步骤。
下面将详细介绍Caco-2细胞的传代流程。
将已培养的Caco-2细胞株从培养瓶中取出，并用PBS（磷酸盐缓冲液）进行洗涤，以去除细胞外的杂质。
然后，使用胰蛋白酶溶解细胞，使细胞与培养瓶表面分离。
胰蛋白酶需要在37摄氏度下孵育一段时间，以确保细胞充分分离。
接下来，将细胞悬浮液转移到新的培养瓶中，并加入适量的培养基。
培养基的配方通常包括营养物质、生长因子和抗生素，以提供细胞所需的营养和生长条件。
细胞在新的培养瓶中继续培养，并在适当的时间点进行观察和评估。
细胞的形态、增殖速率和细胞健康状况是评估细胞传代效果的重要指标。
一般来说，Caco-2细胞的传代周期为1到2周。
当细胞达到80%到90%的密度时，即可进行下一代的传代。
在传代过程中，需要注意以下几点：
1.避免细胞过度生长，以防止细胞过度拥挤和凋亡。
2.保持细胞培养环境的稳定性，包括温度、湿度和二氧化碳浓度的控制。
3.定期更换培养基，以确保细胞获得足够的营养物质。
4.避免细胞受到污染，定期进行细菌和真菌的检测。
通过以上步骤，Caco-2细胞可以成功地进行传代，以维持其稳定的生长和功能特性。
传代过程需要耐心和细心，以确保细胞株的质量和稳定性。
这对于后续的实验和研究工作至关重要。
caco-2细胞单层膜模型tice途径
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细胞渗透性实验步骤
细胞渗透性实验实验材料：1.Caco-2细胞；2.培养基DMEM(高糖，含Gln，无丙酮酸，Gibco/Invitrogen, cat. no. 41965-039)；a)完全培养基DMEM+10% FCS + 1% NEAA (Gibco/Invitrogen, cat. no. 11140-035)；b)DMEM-双抗培养基DMEM+10% FCS+1% NEAA+1%双抗〔Gibco/Invitrogen, cat. no. 15140-122〕；3.0.25%胰酶+EDTA；4.HBSS〔Hank’s balanced salt solution〕(cat. no. H1387)配制1L，加入HEPES〔终浓度25mM〕和NaHCO3〔终浓度0.35g/L〕,调整PH=7.4并过滤除菌〔如果要模拟小肠酸环境或研究质子依赖的转运机制，则以PH=6.5的甲磺酸代替HEPES，终浓度10mM，调整PH=6.5〕；5.DMSO〔在药物不溶于HBSS时使用，99.5%纯度，作为共溶剂，使用时DMSO终浓度不能超过1%〕；6.[14C]mannitol〔supplied by NEN Life Science Products，具有放射性〕或用fluorescentcompound lucifer yellow〔需要的药物浓度高于[14C]mannitol〕7.分析药物含量的溶剂，如HPLC溶剂；8.BSA，如检测脂溶性化合物则需要BSA；9.配制药物，用上述HBSS溶液按需要的浓度溶解药物，使用前检查配制后的溶液PH值，如PH改变，则调整相应的至7.4或6.5。
要点：1.有些药物可能会破坏Caco-2细胞层的完整性，造成通透性升高，一般以[14C]mannitol作为marker，通常完整的Caco-2细胞层通透性为1.2 ± 0.5×10-7 cm s-1，如果通透系数大于5×10-7 cm s-1，则认为单细胞层受到了药物的影响，若通透系数大于1×10-6 cm s-1，则认为单细胞层遭到破坏；2.对于主动转运，首先使用低浓度药物如10μM或更低的浓度进行实验以避免转运蛋白的饱和转运；对于被动运输mM数量级的浓度进行实验，这样，主动运输饱和，此时的运输主要是被动运输。
Caco-2细胞的培养
六、Transwell板上细胞的培养
上板
• 消化细胞 • 细胞计数，上样密度约8×104个/ml • 每孔上室加0.5ml细胞悬液，下室加 1.5ml培养基
隔天换液 约15天之后可做通透实验
谢谢！
• PBS清洗细胞1~2次 • 倒入培养基 • 细胞培养瓶置37℃，5%CO2培养箱中培 养，瓶口应旋开半圈
五、细胞传代
细胞生长至高密度时，即须分至 新的培养瓶中
• • • • • 胰酶消化细胞 加入培养基，停止消化 吹散细胞，1000rpm离心5min 倒去上清，加培养基，吹散细胞 加细胞悬液至细胞培养瓶中，倒培养 基
二、无菌操作
• 容器打开后，用手夹住瓶盖并握住 瓶身，倾斜约45°角取用，瓶盖侧 放 • 实验操作应在操作台中央无菌区域 内进行 • 实验完成胞的冻存：
液氮罐中，-170℃，缓慢冷却
• 细胞的复苏
快融方法，42℃
四、细胞培养
在细胞培养瓶中培养细胞 换细胞培养液
Caco-2细胞的培养技术
费方利 2007-12-30
一、细胞实验的准备工作
• 培养基的配置
DMEM培养基，用滤器过滤后灭菌。
• PBS的配置
配10×的贮存液，用时稀释，120℃灭菌。
• 细胞冻存液的配置
血清：DMSO=9：1
二、无菌操作
• 70%酒精擦拭超净台，实验用品擦 拭后放入超净台，紫外灭菌30min • 擦拭双手，点酒精灯 • 小心取用无菌实验用品，切勿碰触 吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在 打开的容器正上方操作实验。
Caco-2细胞模型解析
培育约 3星期后，其电阻值达到 400 Ω（有的 要求达到 600Ω），它们形成致密的细胞单层， 结构和生化作用类似于小肠上皮细胞， 3-5 天 内适合进行转运试验。
Caco-2 Cell Culture Model
AP Side (Lumen) BL Side (Serosal)
B to A
A to B
③Caco-2 细胞模型可同时对大批量药物进行快速筛
选，所需药物量少，仅需要数毫克即可；
④培养成熟的 Caco-2 细胞是致密的单层细胞，具有 与正常的小肠上皮细胞相同的极性，可以从不同方 向进行摄取和转运实验，可用于区分肠腔内吸收的 差别；
Caco-2细胞模型的局限性 但是， Caco-2 细胞与人小肠上皮也有一定差 异，在研究药物转运中表现出一定的局限性，如: ①缺少粘蛋白产生细胞，缺少肠壁粘液层； ②具有较高的细胞通透性，若喂养次数多，某些酶 载体或细胞内容物溢出； ③缺少某些代谢酶；
道吸收的细胞模型。也是迄今为止的最好的肠道转
运模型和上皮转运模型。
Caco-2细胞系来源于人的直肠癌，其结构和生
化作用类似于人小肠上皮细胞，含有与小肠刷状缘 上皮相关的酶系，与正常的成熟小肠上皮细胞在体 外培育过程中出现逆向分化(反分化)不同，Caco-2 细胞在传统的细胞培养条件下，生长在多孔的可渗 透的聚碳酸酯膜上可达到融合并自发分化为肠上皮 细胞，形成连续的单层(monolayer)。
Apical to Basolateral Transport: Absorptive Transport Basolateral to Apical Transport: Secretory Transport
Efflux to both sides
基于 Caco-2细胞单层模型研究鞣花酸的转运特性
基于 Caco-2细胞单层模型研究鞣花酸的转运特性田莉;谢莉;张慧慧;高晓黎【摘要】目的：研究鞣花酸在 Caco-2细胞单层模型上的转运特性。
方法利用MTT 法确定鞣花酸单体在Caco-2细胞单层模型转运过程的安全浓度区间。
以鞣花酸的表观渗透系数（P app ）和累积转运量为衡量指标，采用高效液相色谱法（HPLC）测定鞣花酸含量，考察不同浓度、不同孵育时间的鞣花酸在 Caco-2细胞单层模型上的双向转运过程。
结果鞣花酸的累计转运量与孵育时间、给药浓度呈正相关，不同浓度的鞣花酸 P app 值差异明显且吸收作用明显强于外排作用，外排比均＜1．5。
结论鞣花酸单体在 Caco-2细胞模型的双向转运过程中以主动转运为主，外排蛋白可能未参与转运过程，鞣花酸为难吸收的一类药物。
%Objective To study the transport behavior of ellagic acid in Caco-2 cell monolayer model.Meth-ods MTT method was employed to confirm safe concentration range of ellagic acid monomer of transport processes in Caco-2 cell monolayer model.The samples concentrations of ellagic acid were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).The apperent partion coefficient value(P app)and the transport total amount were caculated.Bidirection transport behavior of ellagic acid by incubating in different concen-tration and time were study.Results The transport cumulative amount of ellagic acid with incubation time,the administration concentration was positively correlated,the P app values of different concentration ellagic acid have differences and the absorption effect was stronger than platoon role.The efflux ratio (ER) values <1.5.Conclusion The active transport of the ellagic acid monomer in the Caco-2 cell model wasbased on the active transport,Efflux proteins may not be involved in the transport process,ellagic acid be-long to the hard absorption drugs.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】4页(P135-138)【关键词】Caco-2 细胞单层模型;鞣花酸;HPLC;转运【作者】田莉;谢莉;张慧慧;高晓黎【作者单位】新疆医科大学中医学院; 新疆名医名方与特色方剂学重点实验室;新疆医科大学中医学院;新疆医科大学中医学院;新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011【正文语种】中文【中图分类】R963鞣花酸属于没食子酸的二聚体衍生物，是石榴皮中多酚类物质的主要成分之一，约占石榴皮多酚精制物的20.4%[1]。
肠细胞实验报告结果
一、实验背景肠道是人体重要的消化和吸收器官，肠细胞作为肠道的基本功能单位，其结构和功能的研究对于理解肠道疾病的发生机制具有重要意义。
本实验旨在通过体外培养肠细胞，观察其形态、生长和功能变化，以期为肠道疾病的研究提供实验依据。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：人肠上皮细胞（Caco-2）（2）试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、细胞计数试剂盒、MTT试剂盒等2. 实验方法（1）细胞培养：将Caco-2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
（2）细胞形态观察：通过显微镜观察细胞形态、细胞连接和细胞极性等指标。
（3）细胞生长曲线：采用MTT法检测细胞生长情况，计算细胞增殖抑制率。
（4）细胞功能检测：通过检测细胞对胆汁酸、糖类等物质的转运能力，评估细胞功能。
三、实验结果1. 细胞形态观察培养的Caco-2细胞呈典型的铺路石状，细胞连接紧密，细胞极性明显。
细胞在培养过程中，细胞形态保持稳定。
2. 细胞生长曲线通过MTT法检测细胞生长情况，结果显示Caco-2细胞生长曲线呈S型，表明细胞生长受到抑制。
在实验过程中，细胞增殖抑制率随时间延长而增加。
3. 细胞功能检测（1）胆汁酸转运能力：通过检测细胞对胆汁酸（如胆酸钠）的摄取和分泌，评估细胞胆汁酸转运能力。
结果显示，Caco-2细胞对胆汁酸的摄取和分泌能力较强。
（2）糖类转运能力：通过检测细胞对葡萄糖的摄取和分泌，评估细胞糖类转运能力。
结果显示，Caco-2细胞对葡萄糖的摄取和分泌能力较强。
四、讨论与分析1. 细胞形态观察结果表明，Caco-2细胞在体外培养条件下具有良好的形态和功能。
2. 细胞生长曲线显示，Caco-2细胞在体外培养过程中受到一定程度的抑制，可能与培养基成分、细胞密度等因素有关。
3. 细胞功能检测结果显示，Caco-2细胞具有较强的胆汁酸和糖类转运能力，这与肠道细胞的生理功能相一致。
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Caco-2 细胞转运实验人结肠癌细胞系Caco-2是用来研究药物经肠吸收的常用模型。
Caco-2细胞体外培养条件下可自发进行上皮样分化，形成与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接，形态学、标志酶的功能表达及渗透特征都与小肠柱状上皮细胞很相似。
在Caco-2细胞中，主要药物转运体如寡肽转运体PEPTI,P-糖蛋白MDRI、多药耐药相关转运蛋白MRP2和有机阴离子转运多肽OATP2B1均有较高水平表达，能够快速得到药物的跨膜转运属性。
此外，Caco-2细胞还表达一些肠道常见的糖苷酶、氨肽酶、酯酶和代谢酶，可考察存在代谢的情况下药物的转运情况。
由Caco-2细胞获得的药物表观渗透系数（Papp）与人小肠吸收具有良好的相关性，作为药物吸收研究的一种快速筛选工具，Caco-2细胞模型已广泛用于体外药物分子小肠吸收的研究。
Caco-2细胞模型是将Caco-2细胞接种于半透膜（多为聚碳酸酯多孔膜）上，待细胞生长分化为完整的细胞单层（一般21～24天），即可模拟人体肠道上皮吸收屏障，用于药物通透性实验（图11-5）。
近来研究发现，犬肾上皮细胞系MDCK Ⅱ和Caco-2细胞在许多药物的转运上具有很好的相关性，且其培养周期较短(3～5天）即可形成完整细胞单层，可以作为一种改良的Caco-2细胞模型，进行药物的经肠吸收研究（图11-6）。
【材料】1．状态良好的人结肠癌细胞。
2．试剂胰蛋白酶、小牛血清、培养基（DMEM培养粉）、双抗。
乳酸脱氢酶检测试剂盒、酚磺酞或荧光黄、D-Hanks液（每l000ml含NaCl 8.OOg，KC10.40g,NaH2P04·H20 0.06g, NaHC03 0.35g，酚磺酞0.02g) ,Hanks液（在D-Hanks液加MgS04·7H20 0.20g, CaCl2（无水）0. 14g,葡萄糖1.00g) ,75％乙醇。
3．仪器净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、细胞计数板、电阻仪、酶标仪、TransweⅡ小室、HPLC/MS/MS（或核素标记检测）。
【方法】1. Caco-2细胞的培养复苏细胞，加入DMEM培养液（内含10％小牛血清、青霉素100ug/ml、链霉素100 ug/ml )吹打数次，制成细胞悬液，计数。
按（3～5)x104/ml密度接种于培养瓶或培养板中，置37℃,5% CO2的孵箱中培养，12小时后换液一次，以后每2天换液一次。
细胞生长融合80％左右，即可传代培养；显微镜观察Caco-2细胞生长状态良好，形态规则，分化完好，边界清晰，即可进行试验。
MDCK II细胞培养方法相同。
2．接种铺板将状态良好的细胞消化，吹打均匀，调节密度104～105/ml，吸取0.4ml细胞悬液接种于TransweⅡ小室，置于24孔板中，外孔加0.6ml培养液，内外孔液面大致等高。
3．培养换液隔天换液。
Caco-2细胞接种一周后每天换液。
镊子用乙醇棉擦拭消毒，过火冷却后，夹出TransweⅡ小室，倾斜倒出培养液，用移液枪吸出24孔板中培养液后放回TransweⅡ小室，在小室内外轻柔加入适量D-Hanks液，冲洗残留废液；然后加入新鲜培养液，内孔0.4ml外孔0.6ml。
4．检测电阻检测前一天，电极紫外灭菌过夜。
使用前电极用75％乙醇浸泡15分钟，D-hanks 液冲洗后37℃Hanks液孵育30分钟；同时，用37℃Hanks液轻柔地清洗细胞单层3次以除去表面杂质，然后加入37℃Hanks液内孔0.4ml外孔0.6m1置于培养箱中孵育30分钟。
然后，连接电极和机身，打开电阻仪电源，选择电阻挡，按下测试键“test”显示1000Ω（若选择电压挡则为1)，表示状态良好，可以使用。
将电极置于TransweⅡ小室内外侧，没入Hanks液中，内短外长。
最后，按下测量键“measure”，读取电阻值。
测量后弃掉Hanks液，更换新鲜培养液继续培养或进行转运实验。
电极用D-hanks液冲洗后静置阴干。
Caco-2细胞培养21天，TEER值可达到300Ω·cm2。
MDCKⅡ细胞培养3～5天,TEER值可达到100～800Ω·cm2。
5.检测酚磺酞或荧光黄通透率以酚磺酞为例。
用37℃Hanks液轻柔地清洗细胞单层3次以除去表面杂质，然后加入37℃Hanks液内孔0.4ml外孔0.6ml置于培荞箱中孵育30分钟。
在小室内侧（供药侧）加入酚磺酞（终浓度为5 mg/ml )并计时，设定时间点（0.5小时，1小时，2小时，3小时）在小室外侧（受药侧）取Hanks液0.1 ml待测，然后补加相应体积的空白37℃Hanks液；酶标仪检测待测液吸光度，波长560nm；配制标准曲线，计算酚磺酞浓度。
Caco-2细胞培养21天，TEER值达到300Ω·cm2后，酚磺酞（或荧光黄、甘露醇等）的漏出量应＜5% , Papp≤107 cm/s，说明Caco-2细胞单层完整，可用于药物透过研究。
MDCK Ⅱ细胞培养3～5天，酚磺酞等标志物的漏出量和Papp即可达到此水平。
6．通透性实验为了模拟肠道环境，转运实验时，Caco-2细胞单层AP侧缓冲液pH为6.0,BL侧缓冲液pH为7.4，以下缓冲液pH均按照此要求配制。
MDCK Ⅱ细胞单层无此要求。
首先弃去TransweⅡ小室内外培养液，用37℃Hanks液轻柔地清洗细胞表面3次以除去表面的杂质，然后加入37℃Hanks液（内孔0.4ml，外孔0.6ml）置于37℃孵箱中孵育30分钟。
吸去缓冲溶液，在AP侧（内孔）加入0.4ml含有受试药物的Hanks液，作为供给液，在BL侧（外孔）加入0.6m1空白的Hanks液作为接收液。
此为吸收方向，A-B。
7．外排实验弃去TransweⅡ小室内外培养液，在BL(外孔）侧加入0.6ml含有受试药物的Hanks 液，作为供给液，在AP侧（内孔）加入0.4m1空白的Hanks液作为接收液。
此为外排方向，B-A。
8．双向转运实验相同药物同时进行通透性实验和外排实验，考察药物的渗透方向率（PDR)。
9．采样和检测将载有TransweⅡ小室的24孔板于恒温摇床（37℃,50r/min）中温孵，设定时间（0.5小时，1小时，2小时，3小时）从接受池取出50ul的接受液待测，然后补加相应体积的空白37℃Hanks液。
转运实验结束后，夹出TransweⅡ小室，用冰冷D-Hanks（D:去粒子，表示无钙镁）液彻底冲洗，置入新的24孔板中，向小室内加入200ul裂解液，恒温摇床（37℃,50r/min）中裂解2小时。
裂解液测定药物浓度和蛋白含量。
样品加等体积乙腈沉淀蛋白，涡旋，离心，吸取上清液吹干，流动相复溶，涡旋，离心，吸取上清液进样，质谱检测。
蛋白含量用BCA试剂盒测定。
10．实验过程中细胞单层完整性的监测在通透性试验过程中，可以通过监测TEER值、缓冲液中乳酸脱氢酶活性的变化，确保整个过程中细胞单层的完整性；也可以在供给液中加入酚磺酞或荧光黄等标志物，同时测定标志物的通透率作为对照。
［结果与分析]1. TEER值的计算TEER(Ω·cm2)=[测得电阻值-空白小室（未接触细胞的小室，电阻在100～150Ω）电阻值]x0.6cm2（聚碳酸酯多孔膜面积）Caco-2细胞单层TEER值随培养天数递增，15天后渐趋平缓，21天后可达200～600Ω·cm2。
MDCK Ⅱ细胞培养3～5天，TEER值可达到l00Ω·cm2以上。
2．转运图和摄取图通过测定受药侧缓冲液中待测药物的含量以及通透性实验结束后细胞内蓄积的药物含量，可以用转运图和摄取图直观的表示药物的跨细胞转运属性。
转运图的横坐标为时间（min)，纵坐标是单位面积的细胞单层转运的药物量(mol/Cm2)。
由于药物的跨膜转运过程比较缓慢，所以在较长时间内转运图大致为直线上升趋势（图11-7）。
摄取图的纵坐标是单位重量的转运体表达量（以细胞总蛋白量计算）摄取的药物量(mol/mg protein)。
摄取图能反映药物在细胞内的蓄积情况，从侧面反映药物的跨膜转运情况。
3.表观渗透系数（PaPP，cm/s）的计算其中C0是受试药物供给池药物初始浓度，dQ/dt为接收池药物出现的速率，A为聚碳脂膜的表面积。
如果将转运图中横坐标的单位以秒（s）计算，则dQ/dt即为转运图拟合直线的斜率。
再除以A 和Co，即PaPP。
一般认为，吸收良好的药物，其表观渗透系数为PaPP>1×10-6 cm/s；而吸收较差的药物，其PaPP＜1×1O-7 cm/s。
4．渗透方向率（PDR）的计算通过被动转运的药物，不管是细胞旁路还是跨细胞扩散，其PDR均为1左右；如果药物的PDR显著偏离1，则提示主动转运的存在。
例如二肽Gly-Sar，其肠道吸收经由寡肽转运体PEPTI介导，由Caco-2细胞模型得到的PDR (A-B/B-A）为4.8 ;而P-gp的典型底物Rhodamine 123，其PDR(B-A/A-B）可达15左右。
通过分析药物跨膜转运的PDR，可得到药物跨膜转运的作用靶点以及机制等信息。
【注意事项】1．换液TransweⅡ小室内的培养液尽量倒出而不用移液枪，添加培养液时枪头要贴小室侧壁缓慢加液，任何情况下都要避免枪头、镊子及电极等物体与小室底部的多聚碳酸酯膜接触，防止细胞单层和半透膜的破坏。
2．确保的细胞单层完整性Caco-2细胞单层完整是细胞转运模型建立成功的关键，可通过以下方法确保细胞单层的完整性。
①铺板前，用电子显微镜或光学倒置显微镜进行形态学检查，确定Caco-2细胞状态良好才能铺板；②铺板后，无法用显微镜观察细胞形态，须用电阻仪定期测量单细胞层的电阻（TEER）值，TEER应随培养天数而递增，两周后逐步稳定，如果TEER值突然下降，则说明细胞单层被破坏，不能继续培养，用于药物转运实验；③在转运实验进行前或进行过程中，应检测标志物被动扩散的跨膜通量，通常用甘露醇，菊糖，荧光黄及酚磺酞等通过被动扩散转运的小分子，其漏出量应小于5%，满足Papp≤107 cm/s;④在转运实验开始和结束时，应检测缓冲液中乳酸脱氢酶(LDH）的含量，如果细胞单层被破坏，会有大量LDH漏出。
3．确保Caco-2细胞的功能分化碱性磷酸酶是小肠刷状缘细胞的标志性酶，在单细胞层培养的不同阶段应测定其活性，考察Caco-2细胞的分化情况。
但是这种方法必须破坏细胞单层的生长，局限于方法学验证的实验中。
药物通透性实验时，通常进行典型底物的跨膜转运实验，以验证Caco-2细胞的功能分化。
例如考察PEPT1的功能，可通过Gly-Sar的转运情况反映；Rhodamine 123的转运情况则反映Caco-2细胞P-gp的表达情况。