第8章 重组子鉴定与筛选
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重组子的筛选和鉴定
重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR 产物。
1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml 含适当抗生素的LB 培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 次日取菌液0.2-0.5ml，12,000rpm×3min 离心，弃上清，加入20μl ddH2O 和20μl 酚/ 氯仿，震荡混匀，12,000rpm×5min 离心。
3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA 作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl 体系。
酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。
7. 若用PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl ，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
8第八章重组讲义体的筛选
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物比ຫໍສະໝຸດ 观察2.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
合成某一aa的基因 连接
酶切
重组
转化 缺少该aa合成 酶基因的菌株
载体
重组子
生长、获得
筛选
只缺少该aa的 基本培养基
二、核酸分子的物理检测法
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物比ຫໍສະໝຸດ 观察2.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
合成某一aa的基因 连接
酶切
重组
转化 缺少该aa合成 酶基因的菌株
载体
重组子
生长、获得
筛选
只缺少该aa的 基本培养基
二、核酸分子的物理检测法
重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
转化子的筛选和重组子的鉴定
双脱氧末端终止测序法旳基本操作：
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Prime Prime Prime Prime rKlenow rKlenow rKlenow rKlenow dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
聚丙烯酰胺凝胶电 泳A C G T
pUC18 2.7 kb
ori
后经过其长度来鉴定其是否为重组子 Apr
区别重组子与非重组子
假如外源DNA片段插pUC18 旳SphI位点处，原则上也可 用SphI酶解鉴定，但这么做 很不经济，因为SphI非常昂 贵（每100单位50美元）。用 HindIII和EcoRI联合酶解一样 能够到达目旳，但这两种酶 旳价格只及SphI旳1 / 50
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap旳平板
再将Ap平板上旳转化子影印 至具有Ap和Tc旳平板上
缺刻前移标识法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓旳限制性酶切图谱法就是对载体上插入旳外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目旳基因旳已 知图谱对比，所以利用这种措施不但能区别重组子与非 重组子，而且还能鉴定目旳重组子。但这种措施在用于 数千规模旳转化子筛选时，工作量极大，试验成本也高 。
重组子的筛选与鉴定
氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定
2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够 对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发 生体内抑制或互补效应，从而使被转化 的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重 组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功 能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。 将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过 寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据 形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功 能的重组体噬菌体。
缺点： 不单要求克隆的DNA片断必须大到足 以包含一个完整的基因，而且还要求所 编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能 表达。 （对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法 从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶 电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其 长度。 优点：简便、快速。 缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
重组子的筛选与鉴定
丝氨酸杀死。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
重组体的筛选和鉴定
8.1
遗传学检测法
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体 1 抗药性标记及其插入失活选择法 原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。
无环丝氨酸培养基
氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
2.蓝白斑筛选法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
Xgal
半乳糖
+ +
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因 组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
Autoradiogram
Transfer protein
Autoradiography
Protein band detected by specific antibody
SDS-Polyacrylamide gel
Polymer sheet
Autoradiogram
8.4 免疫化学类检测法
对表达产物的检测。蛋白—蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因
在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶 (Cat) 基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳 动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（TK） -- 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） -- 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRT）
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Fields建立了一个双杂交系统：
DBD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，
如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物， 使GAL4两个游离的结构域重新在空间 上接近，则会启动特定基因（报告基因） 的转录
一般将DBD-X的融合蛋白称作诱饵,X
往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物，能 显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告 基因，通过对报告基因表达与否的检测， 可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作 用.
无细胞核的微细胞系统 染色体被UV破坏的大细胞系统 E.coli S30体外翻译系统
大肠杆菌蛋白酶缺陷株抽提物，含T7RNA聚合酶
兔网织红细胞提取物系统
网织红细胞无细胞核，提取物用核酸酶处理破坏内源mRNA，有一定翻 译后加工活性，广泛应用于真核基因体外表达。(FlexiR)
麦胚提取物系统
2.限制酶切分析+电泳
★
插入片段的重组载体的分子量比空载体分子量大。
单一位点酶切：1个片段 2位点酶切：2个片段（一般选择克隆位点） 测序鉴定
Marker 空载体
外源 片段
重组 载体
重组 载体
从转化后的菌体克隆中提取 质粒，酶切后电泳、比较酶 切片段的分子量大小。
4kb
3kb 2kb
2.6kb载体+1.4kb外源片段
GAL4包括两个结构域，位于N端1-147位氨基酸残基区段的
DNA结合域（DNA binding domain，DBD）和位于C端768881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD).
DBD能够识别位于GAL4响应基因（GAL4-responsive gene）
麦胚研磨后的抽提物（S23系统），适于小分子蛋白（<50KD), 适于植 物和真菌蛋白表达（TNTR)
★常用的免疫酶测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制
成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤， 就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤， 这种技术被称为EL1SA （enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫 吸附试验)，属于异相法。
（3）二抗结合 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗 二抗上联着酶标（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）只 识别一抗。 一抗 二抗
（4）显色反应 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物 质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
5.4 免疫印迹（western blotting）技术
外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这些相互 作用无法检测 假阳性：某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激 活作用， 另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与 其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性 "结果。
7. 体外表达筛选技术（ 转译筛选法）☆
检查是否有PCR产物。
PCR产物的长度是否与外源基因一致。
染色体 染色体 marker
4. 核酸杂交检测法
☆
(1).非探针杂交 异源双链杂交，
R-环杂交
★(2). 探针杂交（用于筛选，见基因操作基本技术） 核酸探针：用放射性同位素或荧光基团标记的单链核酸
Southern blotting
5. 6 Broome-Gilbert双位点检测法 用于检测融合蛋白。
质粒基因A
☆
插入基因B
重组质粒
表达融合蛋白
质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支持物 滤膜
抗A抗体
质粒蛋白A
外源蛋白B
标记的 抗B抗体
5.7 其他免疫化学检测技术 ☆ 金（金属离子免疫）标记、电化学发光免疫分析等
6. 酵母双杂交系统
★
酵母双杂交由Fields在1989年提出，其产生是基于对真核细胞转 录因子（酵母转录因子GAL4）2. 限制酶切分析/电泳 3. PCR扩增检测法 4. 核酸杂交检测法 5. 免疫化学检测法 6. 酵母双杂交系统 7. 体外表达筛选技术（ 转译筛选法）
1. 遗传检测筛选法
★
借助抗药性标记基因筛选：如 tet, bla 组织化学法筛选：如lacZ, gusA等 致死基因插入失活: 如sacB等 其他标记基因 ：营养缺陷互补基因、spi等
Ab-E+ Ag——Ab-E-Ag+Ab-E
在抗原反应后，需要先把结合的标记物与游离的标记物分离，然后 测定结合 的标记物（或游离标记物）的量，从而推算出标本中的抗原 量，这种方法称为异相法。 在抗原抗体反应后，结合的标记物失去活力，不需要分离结合的标 记物和游离的标记物就可以测定Ag含量，这种方法称为均相法。
3. PCR扩增检测法
★
原理：设计引物扩增外源片段，如果能在模板序列上扩增出 预期DNA片段，表明外源片段插入载体或基因组
从重组克隆中提取质粒（或DNA）
G TGAAAC ACTTTGACTCCA TGAAACT ACTTTGACTCCA
用外源DNA插入片段引物作PCR
电泳PCR产物。
★
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋 白质泳带。（见基因工程基本技术） 5.5 免疫沉淀检测法
☆
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物 被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体发生抗原-抗体凝集反 应而形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理 （溶菌酶、原噬菌体诱发）。
体外表达技术：借助无细胞核或基因组的转录和翻译系统， 实现特定基因的转录、翻译和检测。常用于体内表达困难的 蛋白质（毒性或易降解）的表达。 其优点为：
减少内源蛋白酶的水解作用，内源mRNA干扰小或没有 可直接以PCR产物作为模板，同时进行转录和翻译（1h 完成合成） ，进行蛋白的快速筛选 高效（能量全用于合成蛋白质），浓度可达mg/ml级，比 体内表达高数百倍 可以通过控制反应条件避免包涵体的形成 高通量合成（用96孔板） 方便加入非天然氨基酸用于蛋白质结构研究
ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品
★
将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中 (含有聚苯乙烯固相载体，非特异性吸附抗原或抗体），干 燥后就被固定在孔底。
孔底
抗原分子表面与抗体特异性结合的化学基团称为抗原决定簇
（2）一抗结合
加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。
如有片段缺失或插入，杂交后还可用电镜直接观察是否有环形的不配对部分
☆
R-环检测
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，加入 作为检测序列的RNA分子，如果DNA中有与RNA互补的 序列，则由于DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳 定而使互补序列的DNA单链被置换出来，形成非常稳定 的R-环结构，电镜下可见。
检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白
质之间的微弱的或暂时的相互作用。
酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细种不同亚细 胞部位的功能蛋白。
缺点：
许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，另
Northern blotting
斑点杂交 原位杂交
☆ 异源双链杂交（HA）
一条DNA异源双链除了单个碱基错配外其余碱基对配对正常，DNA骨架会出 现突起,从而错配的碱基可能会旋入DNA双螺旋沟槽中，或者旋到螺旋的外 部，或者DNA双链可能会在异源双链处发生曲折。因此，在非变性凝胶中电 泳时，具有错配的双链要比没有错的双链移动得慢，从而将突变检出。
的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之 结合.
AD则是通过与转录机器中的其他成分之间的结合作用，以启
动UAS下游的基因进行转录.
DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二
者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并 可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得生相互作用的蛋白及其编码基因
★
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：
作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出
的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
5.2 免疫荧光技术
原理同放射性抗体检测，只是用荧光基团标记来代替放射性核素标记， 常用荧光试剂：罗丹明荧光素、异硫氰酸荧光素等。免疫反应后清洗掉 没有结合的荧光标记物，用荧光显微镜进行定性观测，或者用荧光分光 光度计进行定量检测。
放射性抗体检测法过程
5.3 免疫酶技术
原理同放射性抗体检测，只是用酶标记来代替放射性核素标记， 常用 酶：辣根过氧化物酶（HPR)，碱性磷酸酶等，需要用酶的底物来处理 抗原-抗体结合样品（或膜），如：酶催过程发光，用底片曝光检测。
5. 免疫化学检测法 ★
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用标记的抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达 出相应的蛋白质的外源基因。 5.1 放射性抗体检测法
放射免疫测定技术(radioimmunoassay，RIA):用竞争性结合的原理，应 用放射性同位素标记抗原(或抗体)，与相应抗体(或抗原)结合，通过原 位杂交确定表达抗原或抗体的克隆，也可通过测定抗原-抗体结合物的 放射强度确定待测物的浓度。常用于标记的放射性核素有125I，131I，3H