第六章 目的重组子的筛选与鉴定
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重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
第六章 重组子的筛选与鉴定
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗 掉。二抗只识别一抗。
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、 脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
3. ELISA的局限性
有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性） 必须与其他方法一起综合考虑。
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
X-gal
半乳糖
+ +
葡萄糖 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
1. 原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段
（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌
基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
抗原-抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入
基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，
就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
（三）酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
（3）探针的选择与标记
• 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、 脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
3. ELISA的局限性
有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性） 必须与其他方法一起综合考虑。
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
X-gal
半乳糖
+ +
葡萄糖 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
1. 原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段
（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌
基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
抗原-抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入
基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，
就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
（三）酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
（3）探针的选择与标记
• 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
转化子的筛选和重组子的鉴定
双脱氧末端终止测序法旳基本操作：
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Prime Prime Prime Prime rKlenow rKlenow rKlenow rKlenow dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
聚丙烯酰胺凝胶电 泳A C G T
pUC18 2.7 kb
ori
后经过其长度来鉴定其是否为重组子 Apr
区别重组子与非重组子
假如外源DNA片段插pUC18 旳SphI位点处，原则上也可 用SphI酶解鉴定，但这么做 很不经济，因为SphI非常昂 贵（每100单位50美元）。用 HindIII和EcoRI联合酶解一样 能够到达目旳，但这两种酶 旳价格只及SphI旳1 / 50
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap旳平板
再将Ap平板上旳转化子影印 至具有Ap和Tc旳平板上
缺刻前移标识法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓旳限制性酶切图谱法就是对载体上插入旳外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目旳基因旳已 知图谱对比，所以利用这种措施不但能区别重组子与非 重组子，而且还能鉴定目旳重组子。但这种措施在用于 数千规模旳转化子筛选时，工作量极大，试验成本也高 。
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
47
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法包括以下几种：
1. PCR筛选法：利用PCR扩增方法，在重组子序列两端设计引物，扩增出目标重组子序列。
该方法可快速、简便地筛选出重组子，但存在引物设计不当、PCR 扩增条件不适等问题。
2. Southern blotting法：利用重组子DNA序列特异性探针进行筛选，这种方法需要对目标重组子进行限制性酶切，分离重组子DNA片段，然后进行Southern blotting，根据特异的探针与重组子DNA序列的杂交情况，确定有无目标重组子，这种方法相对复杂，但有高准确性。
3. 包装体筛选法：将目标重组子所在的DNA片段插入载体中，建立重组子文库。
然后采用包装体技术将文库中的重组子片段插入病毒包装体中，再通过病毒感染将重组子片段转染到宿主细胞，筛选出含有目标重组子的克隆。
4. 负筛选法：利用重组子DNA序列中含有的特异性标记，通过筛选方法去除不含该标记的过渡物，从而筛选出含有目标重组子的样品。
以上是常见的几种重组子筛选方法，不同方法适用于不同的实验需求和实验条件。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
重组子的筛选与鉴定
丝氨酸杀死。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
重组体的筛选与鉴定优秀课件
法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
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these colonies have bacteria with recombinant plasmid
2．互补筛选
利用-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒 常采用互补筛选。-半乳糖苷酶 (-galactosidase) 是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用的 -半乳糖酶基因来自大肠杆菌的Lac操纵子，它们使 载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码半乳糖苷酶N末端146个氨基酶的序列。用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨基末端片段的 合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶缺陷 型进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程称互补。
ori
yes yes
Replica plating: transfer of the colonies from one plate
to another using absorbent pad or Velvet (绒布).
transfer of colonies
+ampicillin
+ ampicillin + tetracycline
项首选的方法。
因此当载体带有LacZ调节序列和编码半乳糖苷酸 N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列 缺陷、其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编 码的片段本身都没有活性，但它们互相协助则可在 大肠杆菌内形成一个具有酶活性的蛋白质。故在诱 导物IPTG存在下，细菌在含生色底物5-溴-4-氯-3吲哚--D-半乳糖苷(X-gal)培养基的平板上可形成 蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时， 可使-半乳糖苷酶的氨基末端失活，从而不能进行 互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。
但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未 酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成 的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是 阳性重组子的初步筛选。
同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含 有两个抗药性基因的载体中，通过插入失活其中一 个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选 阳性重组子。如pBR322质粒含有Tetr、Ampr双抗 药性，插入失活Tetr后，Tet r 、Ampr为含载体的阴 性菌落，Tet - 、Ampr表型的菌落为阳性，Tet - 、 Amp - 的表型不能生长，对未转化的受体细胞，该 方法筛选出阳性重组子的几率较高(Tetr：四环素抗 性；Ampr：氨苄毒霉素抗性，Tet - ：对四环素敏感； Amp - ：对氨苄青霉素敏感)
不同检测方法可以归类于以下三个层次： 1. 载体遗传标记检测 2. 克隆DNA序列检测 3. 外源基因表达产物检测
.
一、根据遗传表型筛选
1．抗生素平板筛选 2．互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选
1．抗生素平板筛选
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有 抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗 卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载 体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的 插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子 的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长 成菌落。
蓝白筛选 .
3．插入表达筛选
有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负 调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的 筛选标志基因才能表达，如pTR262质粒其Tetr基因 上 游 存 在 CI 基 因 的 负 调 控 序 列 ， CI 基 因 可 以 抑 制 Tetr 基 因 的 表 达 ， 当 外 源 DNA 片 段 插 入 CI 基 因 的 HindⅢ或Bgl I位点时，Tetr基因阻碍解除而表达， 阳性重组子为Tetr表型，而质粒本身为Tet - 表型， 故转化细菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片 段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落。
.
三、核酸探针筛选
为了进一步确定DNA插入片段的正确性，在内切 酶消化重组子凝胶电泳分离后，通过Southern印 迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性核 素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针， 进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所 需的靶基因片段。
四、PCR筛选
PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短 的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过电泳， 可直接观察到产物的存在。
Screening by insertional inactivation of a resistance gene
Ampr Tcr
pBR322
BX B
ori Ampr
B Ampr
X
Tcr
ori
B
Ampicillin resistant? yes
Tetracycline resistant? No
第Байду номын сангаас章 阳性重组子的筛选和鉴定（检）
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必 须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化 子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重 组子。
• 转化子
• 重组子
.
• 目的重组子
阳性重组子的筛选和鉴定（检）
一、根据遗传表型筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 五、菌落原位杂交技术
一些载体的外源DNA插入位点两侧，存在恒定的 序列，通过与插入片段两侧的SP6及T7启动子互 补的引物，对小量抽提的质粒DNA进行PCR分析， 不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行 DNA序列分析。对于原核或真核系统表达型重组 子，其插入片段的序列正确性是非常关键的，故 有必要对重组子进行序列测定。也可利用已知的 外源DNA的核酸序列，设计特异的引物直接用
PCR进行扩增，并检测产物。
五、菌落原位杂交技术
迄今最为通用的筛选重组子技术仍为菌落或噬菌斑 原位杂交技术，它是先将转化菌直接铺在硝酸纤维 素薄膜或琼脂平板上，再转移至另一硝酸纤维素薄 膜上，用核素标记的特异DNA或RNA探针进行分 子杂交，然后挑选阳性克隆菌落。本方法能进行大 规模操作，一次可筛选5×105制性内切酶酶切分析筛选
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培 养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用 相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入片 段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切酶 消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段 和载体的大小。
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外 源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基 因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区 分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。 但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。
4．噬菌斑筛选
对于以λ噬菌体载体系统，外源DNA插入λ噬菌 体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型 λDNA长度的78％～105％范围内，才能在体外包 装成具有感染活力的噬菌体颗粒，感染细菌后，形 成清晰的噬菌斑。没有外源DNA片段插入的载体 不能包装成噬菌体颗粒，不能感染细胞并形成噬菌
斑，从而达到初步筛选的作用。