生物制药工程：第二章 第六节 重组体的筛选与鉴定
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重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
重组体克隆的筛选和鉴定
抗性筛选
通过载体上的抗性基因，如Amp抗性 基因，对重组体克隆进行筛选，重组 的克隆具有抗性。
筛选流程
转化
将目的基因和载体DNA共转化到大肠杆菌中 。
克隆筛选
根据筛选方法，从转化子中筛选出重组体克 隆。
培养和扩增
将筛选出的重组体克隆进行培养和扩增，以 备后续鉴定。
筛选中的注意事项
避免假阳性
在筛选过程中要严格控制条件，避免出现假阳 性结果。
生物化学鉴定法
通过检测表达产物的生化性质， 如酶活性等，判断目的基因是否 成功表达。
鉴定流程
构建重组体克隆
将目的基因与载体DNA连接， 形成重组体克隆。
转化受体细胞
将重组体克隆导入受体细胞中 ，使目的基因在受体细胞中表 达。
筛选阳性克隆
通过抗性筛选、PCR鉴定等方 法筛选出含有目的基因的阳性 克隆。
生物信息学技术
通过生物信息学技术，可以对重组体克隆进行全面的分析和鉴定，包 括基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。
重组体克隆在其他领域的应用前景
生物制药
重组体克隆技术在生物制药领域具有广泛的应用前景，可用于生 产高纯度、高质量的药物。
生物能源
利用重组体克隆技术可以改良微生物，提高生物燃料的生产效率。
在生物制药领域的应用
药物靶点发现
01
通过筛选重组体克隆，可以发现新的药物靶点，为新药研发提
供基础。
药物作用机制研究
02
通过鉴定重组体克隆，可以深入了解药物的作用机制，为药物
优化提供依据。
药物筛选
03
利用重组体克隆进行高通量药物筛选，提高药物发现的效率。
在基因治疗领域的应用
基因功能研究
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
重组子的筛选与鉴定
氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
直接筛选法
• 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。 • 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不 能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
• 方法：
1 硝酸纤维素膜的准备：将硝酸纤维素膜剪成直径为8cm 的圆形，放人一个干净的平皿内，高压灭菌，待用。 • 2 将无菌的作有标记的硝酸纤维素膜铺在含有相应抗生素 的琼脂糖培养基平皿上，用无菌的L型玻璃棒去除膜与培 养基间的气泡，约1－2min，培养基即可将滤膜浸湿。 • 3 用无菌牙签将转化平皿中选择的菌落接种到滤膜上，同 时接种到另一含有相应抗生素的琼脂糖平皿的对应位置， 并作为标记菌落参照。每个90mm的平皿上大约可接种 100个菌落。
• 4 将平皿置于 37℃培养 2－3h，菌落长到1mm时，把滤 膜转移到另一块含有氯霉素（170ug／ml）的琼脂糖平皿 上，菌落面向上，37℃培养15－20h，扩增质粒。另一个 菌落对照平皿 37℃培养过夜后，密封，4℃保存。 • 5 把滤膜从平皿中取出，菌落面朝上，置于有一薄层变性 液的塑料膜上，变性处理10min，然后用干滤纸吸干变性 液；再将菌落面朝上置于有一薄层中和溶液的塑料膜上， 中和两次，每次15min。室温晾干后，再置于80℃真空干 燥1－2h。
实验17-重组体筛选与鉴定
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30 分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬
试剂：
1.LB固体和液体培养基。
2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。
5. 待转化质粒。
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30 分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬
试剂：
1.LB固体和液体培养基。
2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。
5. 待转化质粒。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
重组体的筛选与鉴定
胞； ➢将含有抗体和溶菌酶的琼脂小心倒在
菌落上。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
（enzyme linked immunosorbent assay）
①固相的抗原或抗体； ②酶标记的抗原或抗体； ③酶作用的底物。
1. 原理： ➢一抗（primary antibody）:
与目标分子的特异结合。 ➢二抗（secondary antibody）：
5.固相核酸杂交的主要过程： 1）核酸的变性； 2）变性核酸在膜上的固定； 3）预杂交； 4）杂交； 5）洗膜； 6）结果显示。
6.几种常用固相核酸杂交方法
1）菌落杂交或噬菌体杂交
把生长在培养基平板上的菌落或噬菌 斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上， 在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用， 以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含 有重组体 (R) 35S-polyA
LB
Kan(R)
EcoRI Hi ndIII 2xEnh
35S-P
i l -4
P4IL4
12.7kb
Nos-T
Hi ndIII RB
三、PCR扩增检测法
利用外源DNA插入位点两侧存在 的特定序列设计引物，对外源 DNA进行PCR分析。
电泳检测法
四、免疫印迹法（western blotting） 1、蛋白质的电泳分离------SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)
点样
电泳方向
凝胶中的蛋白质的染色： 考马斯亮蓝：
灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带， 但可褪色回收。 硝酸银：
灵敏度高、可检出2-5ng/带。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
菌落上。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
（enzyme linked immunosorbent assay）
①固相的抗原或抗体； ②酶标记的抗原或抗体； ③酶作用的底物。
1. 原理： ➢一抗（primary antibody）:
与目标分子的特异结合。 ➢二抗（secondary antibody）：
5.固相核酸杂交的主要过程： 1）核酸的变性； 2）变性核酸在膜上的固定； 3）预杂交； 4）杂交； 5）洗膜； 6）结果显示。
6.几种常用固相核酸杂交方法
1）菌落杂交或噬菌体杂交
把生长在培养基平板上的菌落或噬菌 斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上， 在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用， 以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含 有重组体 (R) 35S-polyA
LB
Kan(R)
EcoRI Hi ndIII 2xEnh
35S-P
i l -4
P4IL4
12.7kb
Nos-T
Hi ndIII RB
三、PCR扩增检测法
利用外源DNA插入位点两侧存在 的特定序列设计引物，对外源 DNA进行PCR分析。
电泳检测法
四、免疫印迹法（western blotting） 1、蛋白质的电泳分离------SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)
点样
电泳方向
凝胶中的蛋白质的染色： 考马斯亮蓝：
灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带， 但可褪色回收。 硝酸银：
灵敏度高、可检出2-5ng/带。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx
此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜
先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制 嘧啶呈 现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含 有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平 为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择 转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是 由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄 主细胞新的抗性表型所致。
6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子
把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主 要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体 包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区； 二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75~105%的长度时，才能在培养平板上 形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不 会包装成பைடு நூலகம்的噬菌体颗粒的。
对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探
针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。
实验17-重组体筛选与鉴定
无环丝氨酸培养基
（2源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
五 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受 态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
克隆的筛选与鉴定
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
试剂：
1.LB固体和液体培养基。
2.含特定抗生素的LB固体培养基。
3.100mM CaCl2溶液。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
重组体的筛选与鉴定优秀课件
法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
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第六节 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二小节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
第一小节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三小节 DNA电泳检测法
BioPesticide Engineering
Hezhong Wang (Ph.D.)
Department Head / Director Department of Pesticide / NanoAgro Center
Henan Agricultural University Email: hezhongw@ Office: Bldg 35# Room 409
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
assword: course
News This Week
期望未来“太空芒果”能解决防虫害问题，提升质量产量 。
第四小节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
▪ 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 ▪ 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。 ▪ 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二小节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
第一小节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三小节 DNA电泳检测法
BioPesticide Engineering
Hezhong Wang (Ph.D.)
Department Head / Director Department of Pesticide / NanoAgro Center
Henan Agricultural University Email: hezhongw@ Office: Bldg 35# Room 409
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
assword: course
News This Week
期望未来“太空芒果”能解决防虫害问题，提升质量产量 。
第四小节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
▪ 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 ▪ 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。 ▪ 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程