生物制药工程：第二章 第六节 重组体的筛选与鉴定
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有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
第一小节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二小节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
wk.baidu.com+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫 测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定 出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
BioPesticide Engineering
Hezhong Wang (Ph.D.)
Department Head / Director Department of Pesticide / NanoAgro Center
Henan Agricultural University Email: hezhongw@126.com Office: Bldg 35# Room 409
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
Lectures loaded on: 百度云 网盘 ID: nanoagro@163.com Password: course
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期望未来“太空芒果”能解决防虫害问题，提升质量产量 。
第四小节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
第六节 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三小节 DNA电泳检测法
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
▪ 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 ▪ 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。 ▪ 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂
第一小节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二小节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
wk.baidu.com+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫 测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定 出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
BioPesticide Engineering
Hezhong Wang (Ph.D.)
Department Head / Director Department of Pesticide / NanoAgro Center
Henan Agricultural University Email: hezhongw@126.com Office: Bldg 35# Room 409
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
Lectures loaded on: 百度云 网盘 ID: nanoagro@163.com Password: course
News This Week
期望未来“太空芒果”能解决防虫害问题，提升质量产量 。
第四小节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
第六节 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三小节 DNA电泳检测法
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
▪ 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 ▪ 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。 ▪ 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂