重组体克隆的筛选和鉴定

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重组质粒的转化及阳性克隆的筛选

(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基因也可能正确表达.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.

14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定

2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须。在不含leu的基本培养基中，只有重组子表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生长，形成菌落。因此，能生长的菌落是阳性的重组子克隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化萦光素，可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生的萦光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中，落后的带是重组DNA的带。此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理：是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子中，获得一系列插入重组子，根据其突变的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。

重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

电泳后的图谱
挑三个菌落鉴定，图显示的是三个菌落中的质粒双酶切的结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性氨苄青霉素（Amp）溶解剂虑过除菌是贮存温度贮存浓度终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm）卡那霉素（Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc）链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法

实验八重组克隆筛选(酶切鉴定)

实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。

不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。

从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。

常用的筛选方法有两类。

一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。

另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。

1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。

这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。

lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。

重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。

因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。

这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。

2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。

本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。

3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。

何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定

带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基（Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率＝产生菌落的总数 / DNA的加入量

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。

首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。

这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。

一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。

比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。

你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。

比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。

时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。

所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。

二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。

在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。

这就像开锁要用对钥匙一样呢。

要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。

各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。

引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。

要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。

还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组等技术构建大规模突变体库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察生物体表型变化，以确定该基因的功能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定基因的表达，观察生物体表型变化，以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突变体，鉴定突变基因，以研究该基因的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上，培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除，观察生物体表型变化，以确定该基因的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测特异的RNA转录本。

重组体的筛选方法

重组体的筛选方法1、重组体的基本筛选概念重组体（recombinant）指从不同生物系统中获取的非天然表达载体，以用于表达特定蛋白质或DNA片段，通常为了检测某种生物活性，以改良生物机理或更改特定特性。

重组体的筛选是对重组体表达的非天然蛋白质进行筛选的过程，可以用来鉴定新的蛋白质、表达具有特定生物活性的蛋白质，或确定新的重组体表达载体。

表达系统筛选通常包括利用基因工程技术在指定载体上表达特定基因编码片段，然后使用分子生物学、免疫学和生物化学方法进行在细胞水平或分子水平上进行分析和筛选，以鉴定具有特定生物活性的重组体表达系统。

2、方法（1）载体筛选。

在大多数重组体表达系统中，筛选的首要任务是识别具有最佳表达能力的载体，其中也可能涉及到大量的载体类型。

可以分别从细胞系、染色体、质粒、全基因组、融合蛋白等不同类型的载体中选择重组体。

有些载体可能会更有效地表达特定基因，而有些可能会产生低产蛋白，因此需要进行大量的筛选才能有效地识别最佳的表达系统载体。

（2）表达率筛选。

在细胞中表达的蛋白质必须具有最大的表达量才能产生最佳的活性，因此对重组蛋白质的表达量非常重要。

在大多数情况下，使用多种不同的表达系统技术来评估重组体表达质量，例如利用Western和Northern blotting、Immunoprecipitation、活性测定和流式细胞术等技术。

（3）特异性筛选。

在获得足够数量的蛋白质之后，必须进一步确定表达体的特异性，特异性不仅取决于重组蛋白质可以被正确表达和结构功能完整，而且应该是特异性，以使其产生预期的生物活性。

因而，重组体的筛选过程还必须包括一项评估表达蛋白质的特异性的步骤，释放的生物活性水平是最重要的特征，在此筛选步骤中，可以使用酶抑制试验、衍生物筛选、细胞学剂量响应性试验或免疫学、化学、物理学方法来评估重组表达体的活性。

3、结论重组体表达是一种实用技术，它旨在确定特定生物学活性的最佳表达系统，以获得有价值的蛋白质或未知活性的分子。

重组子的筛选方法

重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。

随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。

本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。

二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。

其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。

当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。

这种方法操作简便，适用于大量筛选。

2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。

例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。

当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。

这种方法成本低廉，适用于实验室条件。

3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。

该方法灵敏度高，可实现自动化操作。

然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。

4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。

该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。

然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。

三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。

蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。

抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。

荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。

测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。

因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。

实验17-重组体筛选与鉴定

（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+

重组载体构建实验报告

一、实验目的1. 学习重组载体的构建原理和方法；2. 掌握基因克隆、酶切、连接等基本操作；3. 鉴定重组载体的构建成功与否。

二、实验原理重组载体构建是指将目的基因插入到载体中，形成具有特定功能的重组DNA分子。

实验中，通过PCR扩增目的基因，将其与载体进行酶切连接，构建重组载体。

三、实验材料1. 基因组DNA（含有目的基因）；2. 载体DNA；3. 限制性内切酶；4. DNA连接酶；5. DNA标记物；6. 转化试剂；7. 载体宿主菌（如大肠杆菌）；8. PCR试剂；9. 电泳试剂；10. 实验器材。

四、实验步骤1. 目的基因的扩增：以基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术扩增目的基因。

2. 载体的酶切：分别对载体DNA和目的基因进行限制性内切酶酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：将酶切后的载体DNA和目的基因进行连接，形成重组载体。

4. 转化：将连接好的重组载体转化到载体宿主菌中。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：在含有抗生素的培养基上接种转化菌，观察菌落生长情况；b. PCR鉴定：提取转化菌的DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体；c. 酶切鉴定：对PCR鉴定为阳性的转化菌进行酶切，观察酶切图谱与预期结果是否一致；d. 序列分析：对酶切鉴定为阳性的转化菌进行DNA测序，验证目的基因插入载体的正确性。

五、实验结果与分析1. PCR扩增：成功扩增出目的基因片段，大小与预期一致。

2. 酶切：载体DNA和目的基因分别进行酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：连接反应成功，形成重组载体。

4. 转化：转化菌在含有抗生素的培养基上生长良好。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：转化菌在含有抗生素的培养基上生长，说明已成功转化；b. PCR鉴定：PCR扩增结果显示，转化菌中含有目的基因；c. 酶切鉴定：酶切图谱与预期结果一致，证明目的基因已插入载体；d. 序列分析：DNA测序结果与预期序列一致，验证目的基因插入载体的正确性。

8第八章重组体的筛选ppt课件

④结果单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的结果
五、DNaseⅠ足迹实验〔footprinting assay）
检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性
优点：可形象地展示出特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域
1
10
(a)
32p
*
1 10
(b) *
(c)
1. 抗体与产物的结合方式根据第一抗体〔一抗〕和第二抗体〔二抗〕的性质可分为几种作用方式：
固相支持滤膜
一抗
待测基因产物蛋白
125I标记的二抗
固相支持滤膜
一抗
待测基因产物蛋白
二抗
125I 标记的二抗结合蛋白
固相支持滤膜
待测基因产物蛋白
一抗
125I标记的二抗
固相支持滤膜
待测基因产物蛋白
重组子的筛选直接筛选间接筛选dna鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法报告基因等northernblottingwesternblotting标记补救筛选质粒载体的互补筛选蓝白色斑筛选法噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定原位杂交dna序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定一遗传学检测法1根据载体表型特征的筛选1抗药性标记插入失活筛选法第一节核酸分子的遗传学与物理检测法半乳糖苷酶显色反应筛选法蓝蓝白白落落蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落2根据插入基因遗传性状的筛选重组体dna分子转化到大肠杆菌受体细胞之后如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补那么就可以利用营养突变株进行筛选
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。

第七章重组体克隆的筛选和鉴定

第七章重组体克隆的筛选和鉴定
第一节利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理：原理：载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程：（1）四环素抗性插入失活）如果在Tet 上插入外源DNA，导致四如果在 r上插入外源，环素抗性基因失活，可用四环素加环环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。）。
blotting）四、免疫印迹（western blotting）法免疫印迹（在蛋白质凝胶电泳以后，在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理：原理（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂，是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。

重组子的筛选与鉴定

丝氨酸杀死。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法（2）选择过程
假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理（1）弥补缺陷转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不含组氨酸的培养基中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。（一）根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法（二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。

重组克隆的筛选与鉴定.ppt

②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞。
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③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
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图 pBR322的结构图
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2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序，即某种程度的同源性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot）或RNA与RNA（In situ）的二条单链之间进行。
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3. 分子杂交法
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第四节核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选将转化后生长的菌落，复印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上。

鉴定重组子的方法

鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法一般可分为以下几种：
1. PCR扩增法：通过聚合酶链式反应（PCR）在靶DNA序列的两端引入特定的引物，再通过PCR扩增得到重组子的DNA序列。

2. 限制性内切酶消化法：将待重组的DNA片段和载体DNA进行双酶切，然后通过连接酶将两者连接起来，最后通过转化到宿主细胞内进行复制和表达。

3. 嵌合PCR法：利用两对引物分别扩增待重组的DNA片段和载体DNA片段，两者的两端引物设计成互补序列，通过PCR扩增后，两个片段可通过重叠互补序列自行连接。

4. 策略引导融合法：通过引物设计，使待重组的DNA片段和载体DNA具有互补的序列，然后通过热变性和退火的方式使两者相互结合。

5. 基因组DNA文库筛选法：通过构建基因组DNA文库，然后通过探针的杂交和筛选，得到具有重组子的克隆。

以上是常见的鉴定重组子的方法，具体的选择可以根据实验需要和条件进行决定。

重组体的筛选和鉴定

1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合，进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。

转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
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（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补深蓝色（酶活）
半乳糖
β—半乳糖苷酶
α链（lacZα）：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
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二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
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19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG