转化子的筛选与重组子的鉴定(PPT35页).ppt
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感受态细胞的制备、转化与重组子的筛选 .ppt
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
转化
将重组DNA分子导入细菌的过程外源遗传物质(如 质粒DNA等)进入细菌，引起细菌遗传变化的现象。 但外源DNA并不整合到宿主染色体DNA上。这是与 “转导”概念不同之处
转导
借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞 并整合到宿主基因组上的方法。
转染
将外援DNA直接导入真核生物细胞的过程
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（3）用0.5ml预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞； （4）4℃、4000r，离心10min；弃去上清液，加入50µl冰冷 的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。即制成了感受态 细胞悬液。
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（2）互补法 蓝白斑筛选（IPTG-Xgal） 试验：
野生型大肠杆菌产生的b半乳糖苷酶可以将无色化合物Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝 色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜 色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
1抗生素筛选法质粒携带有选择性抗生素基因如氨苄青霉素等可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性将经过转化后的受体细胞经过适当稀释在含氨苄青霉素的平板培养基上培养只有转化子才能存活而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活
实验三：感受态细胞的制备和转化及 重组质粒的筛选
重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
演示文档第六章 目的重组子的筛选与鉴定.ppt
ori
yes
yes
8
Replica plating: one plate
to another using absorbent pad or Velvet (绒布).
transfer of colonies
+ampicillin
+ ampicillin + tetracycline
噬菌斑，从而达到初步筛选的作用。
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14
二、应用限制性内切酶酶切分析筛选
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培 养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用 相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入 片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切 酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片 段和载体的大小。
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2
不同检测方法可以归类于以下三个层次： 1. 载体遗传标记检测 2. 克隆DNA序列检测 3. 外源基因表达产物检测
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3
一、根据遗传表型筛选
1．抗生素平板筛选 2．互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选
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4
1．抗生素平板筛选
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有 抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗 卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载 体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的 插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子 的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长 成菌落。
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11
蓝白筛优选选文档
12
3．插入表达筛选
有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负 调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的 筛选标志基因才能表达，如pTR262质粒其Tetr基因 上 游 存 在 CI 基 因 的 负 调 控 序 列 ， CI 基 因 可 以 抑 制 Tetr 基 因 的 表 达 ， 当 外 源 DNA 片 段 插 入 CI 基 因 的 HindⅢ或Bgl I位点时，Tetr基因阻碍解除而表达， 阳性重组子为Tetr表型，而质粒本身为Tet - 表型， 故转化细菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片 段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落。
论文-实验DNA的连接重组质粒转化筛选ppt课件
F. 培育后，将平皿于４℃下放置数小时，使显色完全。
G. 对照 1：以蒸馏水替代pBS质粒DNA，其它同上。
H. 对照 2：以蒸馏水替代pBS质粒DNA，在步骤E 中，取 5l涂
I.
布于不含Amp的挑选平板上。
３. 重组子挑选
不带有ｐBS质粒DNA的细胞，由于无amp抗性，不能在含有 amp的挑选培育基上成活。带有ｐBS载体的转化子由于 具有-半乳糖苷酶活性，在X-gal和IPTG培育基上为蓝 色菌落(在麦康凯挑选培育基上呈现为红色菌落)。带有 重组质粒转化子由于失了-半乳糖苷酶活性，在麦康凯 选择性培育基及X-gal和IPTG培育基上均为白色菌落。
二、操作步骤
1．衔接反响
A. 取新的经灭菌处置的0.5ml eppendorf管，编号。 B. 将0.1ug载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩
尔量〔可稍多〕的外源DNA片段。 C. 加蒸馏水至体积为8ul，于450C保温5分钟，以
使重新退火的粘端解链。将混合物冷却至00C。 D. 参与10 X T4DNA衔接酶缓冲液1ul、T4DNA衔
பைடு நூலகம்
2．pBS重组质粒的挑选原理
由 -互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物 X-gal〔5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷〕的存在下被 IPTG〔异丙基硫代- -D-半乳糖苷〕诱导构成兰色菌落。 当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码 框架改动，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去 -互 补才干，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱 导培育基上只能构成白色菌落。
实验六、DNA的衔接、重组质粒的转化及挑选
一、概述
假设要克隆较小的DNA片段〔<10kb〕，质粒要比其他任何 载体都好，在质粒载体上进展克隆，其根本过程是，先用限 制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后在体外使两 者相衔接，再用所得到的重组质粒转化细菌，即可完成。
G. 对照 1：以蒸馏水替代pBS质粒DNA，其它同上。
H. 对照 2：以蒸馏水替代pBS质粒DNA，在步骤E 中，取 5l涂
I.
布于不含Amp的挑选平板上。
３. 重组子挑选
不带有ｐBS质粒DNA的细胞，由于无amp抗性，不能在含有 amp的挑选培育基上成活。带有ｐBS载体的转化子由于 具有-半乳糖苷酶活性，在X-gal和IPTG培育基上为蓝 色菌落(在麦康凯挑选培育基上呈现为红色菌落)。带有 重组质粒转化子由于失了-半乳糖苷酶活性，在麦康凯 选择性培育基及X-gal和IPTG培育基上均为白色菌落。
二、操作步骤
1．衔接反响
A. 取新的经灭菌处置的0.5ml eppendorf管，编号。 B. 将0.1ug载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩
尔量〔可稍多〕的外源DNA片段。 C. 加蒸馏水至体积为8ul，于450C保温5分钟，以
使重新退火的粘端解链。将混合物冷却至00C。 D. 参与10 X T4DNA衔接酶缓冲液1ul、T4DNA衔
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2．pBS重组质粒的挑选原理
由 -互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物 X-gal〔5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷〕的存在下被 IPTG〔异丙基硫代- -D-半乳糖苷〕诱导构成兰色菌落。 当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码 框架改动，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去 -互 补才干，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱 导培育基上只能构成白色菌落。
实验六、DNA的衔接、重组质粒的转化及挑选
一、概述
假设要克隆较小的DNA片段〔<10kb〕，质粒要比其他任何 载体都好，在质粒载体上进展克隆，其根本过程是，先用限 制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后在体外使两 者相衔接，再用所得到的重组质粒转化细菌，即可完成。
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
转化子的筛选和鉴定
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落原位杂交法的基本操作：
影印
用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光
感光
杂交
洗涤
克隆DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
将外源DNA片段插在EcoRI位点： Pst I 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr
将外源DNA片段插在BamHI位点：
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片 段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因 此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定 目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法：
或者： 1.0 kb + 5.7 kb
1.0 kb BE
0.8 kb PB
4.0 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI lacZ’
用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb
或者： 0.8 kb + 5.9 kb
5' P
OH 3'
基因工程重组子选择筛选与分析精品PPT课件
2．利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因(reportor gene)，常用的报告基因有 抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 ① 新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II, NPTII）基因 新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和 G418 等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核 细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成， 进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上- 磷酸基团转 移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶 位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选 择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细 胞才能存活下来。
（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞 Bar基因是1987年从水链霉菌中分离出来的，它编码的PPT- 乙酰 转移酶(PAT)能够解除非选择性除草剂的毒性。PPT是L-谷氨酸 的类似物，能强烈抑制谷氨酰胺合成酶(Gs)的活性，而谷氨酰胺 合成酶一旦受到抑制，将会导致植物体内氨的迅速积累，并使植 株死亡。 Bar基因的表达产物PAT通过对PPT的乙酰化从而解除 PPT的毒性，可以使转化植物细胞产生对除草剂的抗性。
② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯 霉素乙酰转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化 而失效。
③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能 修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。 四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变 细菌膜的蛋白，防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 ⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能 修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
第三节重组子的筛选与鉴定-西安电子科技大学个人主页系统.ppt
只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交， 在底片上曝光显示。
三、核酸分子杂交检测法
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 2 用（或）探针检测样品。
主要检测插入片断是 否被转录。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法
3. 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
从转化后的 菌体克隆中分离 质粒，电泳、比 较其分子量。
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法 1. 原理 根据已知的外源序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法
A或B
二、物理检测法
A
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 待测基因
125I标记的二抗
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法
2. 放射性抗体检测法过程
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
节重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法 二、物理检测法
第三节 重组子的筛选与鉴定
相关概念 转化子
导入外源基因分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子
含有重组分子的转化子； 筛选和选择
经过各种方法将外源分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 筛选
三、核酸分子杂交检测法
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 2 用（或）探针检测样品。
主要检测插入片断是 否被转录。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法
3. 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
从转化后的 菌体克隆中分离 质粒，电泳、比 较其分子量。
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法 1. 原理 根据已知的外源序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法
A或B
二、物理检测法
A
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 待测基因
125I标记的二抗
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法
2. 放射性抗体检测法过程
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
节重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法 二、物理检测法
第三节 重组子的筛选与鉴定
相关概念 转化子
导入外源基因分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子
含有重组分子的转化子； 筛选和选择
经过各种方法将外源分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 筛选
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
重组体的筛选与鉴定优秀课件
法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
基因工程 外源基因导入及转化子筛选鉴定80页PPT
考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA
载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求
算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选
（三）转化率的影响因素
（1）载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
酵母菌
毕赤酵母 啤酒酵母 哺乳动物细胞 CHO
2.5.2 重组DNA导入受体细胞的途径
转化的原理与技术 转化率 转化细胞的扩增
一、转化的原理与技术
（一）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴 性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术， 其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶 结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出 现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
区分重组子与非重组子
用BamHI酶切转化子质粒 kb PB
4.0 kb
重组子： 2.7 kb + 4.0 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI 非重组子： 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb， lacZ’
TR
dTMP
dTDP
dTTP
（三）显色筛选法
（1）显色筛选法的基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可 区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携 带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色 反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质 粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等
载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求
算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选
（三）转化率的影响因素
（1）载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
酵母菌
毕赤酵母 啤酒酵母 哺乳动物细胞 CHO
2.5.2 重组DNA导入受体细胞的途径
转化的原理与技术 转化率 转化细胞的扩增
一、转化的原理与技术
（一）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴 性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术， 其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶 结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出 现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
区分重组子与非重组子
用BamHI酶切转化子质粒 kb PB
4.0 kb
重组子： 2.7 kb + 4.0 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI 非重组子： 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb， lacZ’
TR
dTMP
dTDP
dTTP
（三）显色筛选法
（1）显色筛选法的基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可 区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携 带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色 反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质 粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等
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在 Ap 平 板 上 生 长 、 但 在 Ap+Tc平板上不长的转化子 为重组子
Ap
挑
影
选
印
Ap+Tc
营养缺陷性筛选法
基本原理：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组 子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因， 而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子 。
全酶解图谱法
dTTP
AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TK
TR
dTMP
dTDP
dTTP
显色模型筛选法
基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非 重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物 能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等。
三者的关系
期望重组子 重组子 转化子
转化子的筛选与重上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或 重组子
❖基于克隆片段序列的筛选与鉴定
由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期 望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至 少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有 广泛的实用性
基本原理图示：
Lys−
Lys+
Lys−
Lys+
常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk， 相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：
dCDP
AP
dTDP
LOGO
转化子的筛选与重组子的鉴定
为什么要进行转化子的筛选和重组 子的鉴定？
在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物 一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此 必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、 期望重组子与非期望重组子。
❖转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 ❖非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 ❖重组子：含有重组DNA分子的转化子。 ❖非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 ❖期望重组子：含有目的基因的重组子。 ❖非期望重组子：不含目的基因的重组子。
显色筛选法的基本操作：
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的 lacZ’ 标 记 基 因 内 部 ， 使 之 灭 活 ， 此 时 重 组 子 呈 Apr 、 lacZ- ， 淡 黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈 Apr
Ap + X-gal
、lacZ+，蓝色菌落
重组子（Apr + lacZ-）
❖基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过 检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
抗药性筛选法 营养缺陷性筛选法 显色模板筛选法 噬菌斑筛选法
抗药性筛选法
可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
将外源DNA片段 插入BamH I、Sal I位点
lacZ' ori
pUC18
Apr
噬菌斑筛选法
1.取代型载体 噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。 2.插入型载体 根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ′）
重组子 非重组子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
PCR鉴定法 菌落原位杂交法 限制性酶切图谱法 亚克隆法 DNA序列测定法
PCR鉴定法
PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA 特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR 技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定 期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的 基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。 上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落 分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万 个转化子的鉴定。
缺刻前移标记法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已 知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非 重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于 数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高 。
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap的平板
再将Ap平板上的转化子影印 至含有Ap和Tc的平板上
原位杂交的操作程序
探针的制备
探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键 最佳的探针长度范围为100~1000bp 探针内部不能含有大面积的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。
探针的获取方法：
1、目的基因的同源序列 2、cDNA 3、人工合成
探针的标记
探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位 示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。
单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。
探针标记方法：
1、5＇端标记法。 2、反转录标记法。 3、缺刻前移标记。 4、ABC标记法。
5＇端标记法
P
T4-PNP酶
P P
DTT、Mg2+、 [γ-32P]dATP、过量ADP
P P
P
变性制备单链探针 方法1
P
碱性磷酸酶
T4-PNP酶
P
方法2
工作原理：
受体基因组
转化子 重组子
非期望 期望重 重组子 组子
转化子 期望重组子
非整合子 整合子
菌落原位杂交法
菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成 千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前 提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探 针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的 杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团 进行定位检测。
Ap
挑
影
选
印
Ap+Tc
营养缺陷性筛选法
基本原理：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组 子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因， 而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子 。
全酶解图谱法
dTTP
AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TK
TR
dTMP
dTDP
dTTP
显色模型筛选法
基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非 重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物 能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等。
三者的关系
期望重组子 重组子 转化子
转化子的筛选与重上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或 重组子
❖基于克隆片段序列的筛选与鉴定
由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期 望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至 少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有 广泛的实用性
基本原理图示：
Lys−
Lys+
Lys−
Lys+
常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk， 相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：
dCDP
AP
dTDP
LOGO
转化子的筛选与重组子的鉴定
为什么要进行转化子的筛选和重组 子的鉴定？
在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物 一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此 必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、 期望重组子与非期望重组子。
❖转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 ❖非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 ❖重组子：含有重组DNA分子的转化子。 ❖非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 ❖期望重组子：含有目的基因的重组子。 ❖非期望重组子：不含目的基因的重组子。
显色筛选法的基本操作：
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的 lacZ’ 标 记 基 因 内 部 ， 使 之 灭 活 ， 此 时 重 组 子 呈 Apr 、 lacZ- ， 淡 黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈 Apr
Ap + X-gal
、lacZ+，蓝色菌落
重组子（Apr + lacZ-）
❖基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过 检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
抗药性筛选法 营养缺陷性筛选法 显色模板筛选法 噬菌斑筛选法
抗药性筛选法
可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
将外源DNA片段 插入BamH I、Sal I位点
lacZ' ori
pUC18
Apr
噬菌斑筛选法
1.取代型载体 噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。 2.插入型载体 根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ′）
重组子 非重组子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
PCR鉴定法 菌落原位杂交法 限制性酶切图谱法 亚克隆法 DNA序列测定法
PCR鉴定法
PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA 特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR 技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定 期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的 基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。 上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落 分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万 个转化子的鉴定。
缺刻前移标记法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已 知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非 重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于 数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高 。
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap的平板
再将Ap平板上的转化子影印 至含有Ap和Tc的平板上
原位杂交的操作程序
探针的制备
探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键 最佳的探针长度范围为100~1000bp 探针内部不能含有大面积的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。
探针的获取方法：
1、目的基因的同源序列 2、cDNA 3、人工合成
探针的标记
探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位 示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。
单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。
探针标记方法：
1、5＇端标记法。 2、反转录标记法。 3、缺刻前移标记。 4、ABC标记法。
5＇端标记法
P
T4-PNP酶
P P
DTT、Mg2+、 [γ-32P]dATP、过量ADP
P P
P
变性制备单链探针 方法1
P
碱性磷酸酶
T4-PNP酶
P
方法2
工作原理：
受体基因组
转化子 重组子
非期望 期望重 重组子 组子
转化子 期望重组子
非整合子 整合子
菌落原位杂交法
菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成 千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前 提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探 针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的 杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团 进行定位检测。