杏鲍菇组织分离实验方案

杏鲍菇组织分离实验方案实验目的1、通过新鲜杏鲍菇子实体的组织分离得到杏鲍菇纯菌种，学习其原种及栽培种的制备，并尝试性地进行出菇试验；2、学习并掌握珍稀食用菌——杏鲍菇菌种的制备过程，理论联系实际，同时为暑期到榕珍菌业实习做准备；3、通过亲身实践，发现自身存在的理论及实践方面的不足，为接下来的食用菌理论知识的系统学习指明方向，同时锻炼自己对食用菌菌种分离的操作及相关知识的熟悉，为以后独立实验打下坚实的基础。

实验内容1.杏鲍菇子实体的采集及预处理；2.杏鲍菇子实体的组织分离及纯化；3.杏鲍菇菌种的观察、鉴定、保藏；4.杏鲍菇原种、栽培种制备及出菇试验；实验原理1.杏鲍菇介绍杏鲍菇（Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳、雪茸，分类学上属于担子菌亚门（Basidiomycetes)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，侧耳科(Pleutotaceae)，侧耳属(Pleurotus)。

杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，并且食之有一种特殊的杏仁香味，商品性状好，有“杏鲍菇王”、“干贝菇”等美称。

杏鲍菇干品含蛋白质21.44%，脂肪1.88%，还原糖2.17%，总糖36.78%，甘露醇2.27%，游离氨基酸2.36%，总碳水化合物57.35%，水溶性成分66.9%，灰分7.83%，水分11.56%。

杏鲍菇入药有降血压和降血脂的作用，杏鲍菇寡糖含量丰富，与双歧杆菌共用，有改善肠胃功能和美容的效果。

杏鲍菇被列为21世纪最具开发潜力的食用菌之一。

由于其生产周期短、见效快、效益相对较高，在农村种植结构调整中非常受欢迎，种植面积在不断扩大，是近几年深受国际市场欢迎的珍稀食用菌。

2.杏鲍菇生物学特性2.1形态特征子实体单生或群生，视基质营养和水分及菌丝生理度而异；菌盖幼时略呈弓形；后渐平展，成熟时其中央凹陷呈漏斗状，直径2～12cm不等，一般单生个体稍大，群生时偏小；菌盖幼时呈灰黑色，随着菇龄增加渐变浅，成熟后变为浅土黄、浅黄白色，中央周围有辐射状褐色条纹，并具丝状光泽；菌肉纯白色，杏仁味明显，破口处短时间变干黄；菌褶延生不齐、白色，与普通杏鲍菇相同；菌柄长2～8cm，直径0.5～3cm，不等粗，基部膨大，呈球茎体状；多侧生或偏生，中实，肉白色、纤维态，吸水性较强。

2.2生态习性杏鲍菇广泛分布于德、意、法、捷、匈及印度、巴基斯坦等国，我国新疆及川西等地亦有野生分布，大多着生于朽死的刺芹、阿魏等植物根部及四周土层中，具一定寄生性，故推测可能与其着生基质中有某种成分驱避害虫使其得到有效保护有关。

2.3生理特征营养条件：杏鲍菇分解纤维素、木质素、蛋白质的能力较强，对葡萄糖、果糖和麦芽糖等碳源的利用率较高，实际生产中，各种农副产品的下脚料和农作物秸秆可作为杏鲍菇的培养料，将棉籽壳、木屑等作为主要原料，调配氮源时以麦麸等作为主要辅料，以降低生产成本，并同时提高菌丝长速及其活力。

温度条件：温度是在栽培杏鲍菇的关键因素。

杏鲍菇居室内生长适温为20-28℃，子实体生长适温为10-18℃。

水分条件：杏鲍菇菌丝生长阶段培养料含水量一般为60%-65%，子实体发育期间空气相对湿度为85%-95%为宜，但不宜向菇体上喷水。

光照及CO2条件：杏鲍菇菌丝生长不需要光线，却需新鲜空气。

CO2对菌丝生长有促进作用，出菇期需要500-1000lx的光照，并需加强通风换气。

pH条件：菌丝生长最适pH为6.5-7.5，出菇期最适pH为5.5-6.5。

3.杏鲍菇母种培养基3.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) g/1000mL马铃薯（去皮）200，葡萄糖20，琼脂20，水1000mL。

3.2杏鲍菇母种培养基[1]g/1000mL马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，蛋白胨2，KH2PO4 0.6，MgSO4 0.5，水1000mL3.3马铃薯葡萄糖酵母粉琼脂培养基(PDYA) [2]g/1000mL马铃薯（去皮）45，葡萄糖30，琼脂25，蛋白胨1.5，酵母膏3，水1000。

4.杏鲍菇子实体预处理及组织分离：杏鲍菇的菌种分离方法有组织分离法、孢子分离法等。

4.1. 组织分离法组织分离法（tissue isolation）是用子实体内部菌肉组织来获得菌种的一种最简便的方法，是生产上常用的一种分离菌种的方法。

子实体组织分离法，选择优良的种菇作为分离材料，用无菌水冲洗后，用75%的酒精溶液表面消毒。

取消毒锅的刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织（火柴头大小），接种到培养基上3~5天后，组织块上即可长出白色绒毛状菌丝，说明分离成功。

组织分离是一种无性繁殖过程，所得到的菌种室营养后代，后代不易变异，菌株可保持原品种的优良品质。

但如采用感染病毒的子实体进行组织分离时，常得到带病毒的菌丝体。

金针菇盖小而薄，可取菌柄上方生长点作为分离部位；胶质菌类（如黑木耳）最好采用尚未展开耳片的耳基团内的组织进行分离，则可能获得较好的效果。

1.2. 孢子分离法在无菌操作条件下使孢子在适宜的培养基上萌发，长成菌丝体而获得纯菌种的方法称为孢子分离法（spore isolation）。

其特点是：菌丝菌龄短，因时有性繁殖产物，其菌丝生命力强。

侵染病毒的菌类可用孢子分离法脱毒。

在一般菌种分离中，为了避免异宗接合的菌类如香菇、杏鲍菇产生单孢子不孕现象，一般都采用多孢子分离法（muti-spore isolation）。

单孢子分离法（single-spore isolation）主要应用于食用菌的杂交育种。

但双胞蘑菇、草菇等同宗接合菌类可采用单孢子分离法。

整菇插种法:整菇插种法，需用一套孢子收集器来收集孢子，将钟罩上的孔加上棉塞或包上6~8层纱布，放在垫有4~6层纱布（浸过0.1%升汞液）的搪瓷盘上，纱布上放一培养器，用0.1%升汞溶液或0.25%新洁尔灭浸泡2~3min，以杀死表面的杂菌。

按无菌操作要求移入孢子收集器，插在支架上，在适宜的温度中培养。

2~3天后孢子散落在培养皿中，加入无菌水，用针筒吸取孢子液，接种在斜面培养基中央，置于22~26℃恒温培养箱中培养即可。

钩悬法:在生产上，采集木耳、银耳孢子常用此法，伞菌也可采用此法。

先将新鲜成熟的耳片用无菌水冲洗，然后用无菌纱布将水吸干，取一小片挂在灭菌的钩子上（伞菌则消毒后挂上），钩上的另一端挂在三角瓶口，瓶内装有培养基，在25℃下培养24h.孢子落到培养基上后，取出耳片，塞上棉塞继续培养，然后再转入试管中培养。

5.杏鲍菇菌种鉴定（1）母种菌丝洁白、浓密、粗壮、生长整齐，有光泽、匍匐状、气生菌丝发达、不产生色素。

居室内生长速度快，在20-22℃条件下，6-8d长满斜面，接种块周围无菌丝稀疏区。

菌丝粗壮，生长整齐，气生菌丝少，有清香的为优良品种。

（2）原种、栽培种菌丝密集、洁白，长势均匀、粗壮，呈绒毛状，有爬壁现象，在培养基表面有少量珊瑚状小菇蕾出现。

原种长满瓶（袋）10d左右使用，栽培种长满瓶（袋）15d内使用。

6.杏鲍菇菌种保藏常用的保藏方法有以下几种：一、斜面低温保藏法斜面低温保藏，又叫定期移植保藏法。

是常用的最简便的保藏法，将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，培养到接近成熟后，放在4℃～5℃的冰箱中保藏。

二、矿油保藏法矿油（主要是液体石蜡）保藏，又称液体石蜡覆盖保藏。

用此法保藏，不需要太多的设备，操作简便，只需在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡，即可使菌种与外界空气隔绝，达到防止培养基水分散失，抑制菌种新陈代谢，延长保存时间的目的。

一般室温下可保藏5～7年，期间1～2年应移接1次。

用此法保藏的菌种不必置于冰箱内，室内保藏即可。

7.杏鲍菇栽培工艺实验器材1.药品：药品名称数量（类型）马铃薯2-3个葡萄糖（蔗糖）20-22g蛋白胨2gKH2PO4 0.6gMgSO40.5g琼脂25g2.仪器：仪器名称数量（类型）试管20-25支三角锥形瓶2-3个(250mL、500mL)烧杯5-8个(50mL、500mL)接种环（针）1-2个量筒1000mL玻璃棒1根电热干燥箱1个手提式高压灭菌锅1个精密pH试纸pH=4.5-7.0恒温恒湿培养箱1个显微镜（OLYMPUS）载玻片，盖玻片，擦镜纸其他必备物品：仪器：长颈漏斗、培养基分装器（见微生物实验书）、棉花、报纸、牛皮纸、纱布、麻绳、标签、牛角匙、天平、打火机、水果刀等实验步骤1.杏鲍菇子实体准备及预处理：在市场上购买新鲜的杏鲍菇作为实验材料，准备好试管，以及各种工具。

培养基的配制及灭菌：按照上述的培养基配方配制好相应的培养基，自然pH，用高压灭菌锅在0.1MPa，121℃下灭菌30min，趁热分装到已灭菌的试管中，制得试管斜面培养基。

具体过程：1.配制柠檬酸溶液（0.08%）；2.斜面培养基配制具体操作：称取马铃薯（新鲜、去皮、切成小块），置于加热锅中，加水1000mL,然后煮沸30min，期间用玻璃棒定时搅拌防糊底。

然后用双层纱布过滤取滤液加入其它成分（除琼脂）充分溶解，加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水至950mL，调节pH值至5.5。

此溶液置于1000mL锥形瓶中，然后分装到试管中，5支为一单位扎捆在一起，包上牛皮纸，在0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌30min。

待PDA 培养基冷却到60℃左右，摆斜面，斜面长度以斜面顶端距棉塞40-50mm为标准（距试管口1/4处即可）。

在培养基凝固之前，不宜再行摆动。

2.杏鲍菇组织分离：把斜面培养基和工具放入超净工作台中，紫外线照射30min。

再把子实体放入其中，子实体表面不需要任何的药物消毒。

在超净工作台中无菌操作，用接种铲或手术刀、接种针等工具取菌柄中央或菌盖中央的菌肉组织，在每支试管的斜面中央放一粒黄豆大小的组织块，将试管放置于25℃恒温培养箱中培养并观察。

原种及栽培种制作：原种和栽培种其营养条件相似，制作方法基本相同。

原种和栽培种培养基的种类很多。

常用配方发菌管理：一般应调控温度在15～30℃范围；最佳25℃，空气相对湿度65%-70％左右；并有少量通风，尽管杏鲍菇菌丝可耐受较高浓度二氧化碳，但仍以较新鲜空气对菌丝发育有利；此外，密闭培养室使菌袋在黑暗条件下发菌，既是菌丝的生理需求，同时也是预防害虫进入的有效措施之一。

一般40天左右，菌丝可发满全瓶（袋）。

出菇管理：杏鲍菇的出菇温度因菌株而异，一般为中温型，利用自然温度进行室内栽培，可在气温稳定在10℃，但最高温度不超过30℃时安排出菇；利用塑料大棚安排出菇时，宜在气温8℃～25℃时进行，这样，经升温保温，棚温可保持在13℃左右；或经加厚覆盖、喷水降温，降至20℃以下，该温度范围内，一般可满足杏鲍菇子实体生长需求。

催蕾阶段：菌袋发满后，再维持7天左右令菌丝充分生理成熟，然后移入菇棚，剪掉扎口或拔除棉塞、去掉套环后将袋口翻下，也可剪掉，露出料面。