碱裂解法提取质粒原理
碱裂解发制备质粒DNA原理
碱裂解发制备质粒DNA原理碱裂解发制备质粒DNA原理试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺酸钠进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性（NaOH 对细胞的裂解作用强于SDS）。
用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、pcr扩增、银染序列分析等。
各试剂的作用：1、溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。
葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA 是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。
从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。
2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，这个用的时候需现配。
要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。
NaOH是最佳溶解细胞的试剂。
SDS-碱裂解法原理
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
碱裂解法提取质粒
碱裂解法抽提质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，以下碱裂解法制备质粒的原理。
碱法质粒抽提用到三种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。
这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。
碱裂解法提质粒原理详解
碱裂解法提质粒原理详解碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法。
它利用高碱性溶液对细菌的细胞壁和膜进行破坏，释放出细胞内的质粒。
下面将详细介绍碱裂解法的原理及其步骤。
碱裂解法的原理基于细菌细胞壁和膜对碱性条件的敏感性，而质粒较为稳定，可以在高碱性溶液中存活。
在碱性条件下，细菌的细胞壁和膜会发生严重的破坏，释放细胞内的质粒。
此外，高温和刺激性离子（如氢氧根离子）也可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
碱裂解法的步骤如下：1.首先，从含有目标质粒的培养基中取得细菌菌落，将菌落转移到含有适当抗生素的培养基中进行培养。
这是为了确保获得含有目标质粒的细菌。
2.将培养好的细菌转移到含有高盐浓度的溶液中。
高盐浓度可以破坏细菌细胞壁的结构，促进质粒的释放。
3.加入碱性溶液，通常使用0.2MNaOH或0.1MNaOH。
高碱性条件可以破坏细菌细胞膜，释放质粒。
此外，高温还可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
4.在碱性条件下，轻轻搅拌混合物，以促进细胞壁和膜的破坏，并使质粒更易于释放。
5. 加入中和缓冲液（例如Tris-HCl），以中和溶液的pH值。
这是为了避免碱性条件对质粒产生不利影响。
6.将混合物进行离心，以分离细胞碎片和质粒。
离心过程中，较大的碎片会沉淀在离心管底部，而质粒会悬浮在上层液体中。
7.将上层液体转移到新的离心管中，并进行再次离心。
这是为了进一步净化质粒，去除可能残留的细胞碎片。
8.倒掉上清液，并用含有合适抗生素的培养基再次进行培养。
这是为了筛选出仍然带有目标质粒的细菌。
总的来说，碱裂解法通过破坏细菌的细胞壁和膜，释放出细胞内的质粒。
该方法简单、快速，并且适用于大多数质粒的提取。
然而，需要注意的是，碱裂解法也会破坏部分目标蛋白质的结构，因此在选择提取方法时需要综合考虑。
碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化
实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。
二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；（6）12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min。
碱裂解法提取质粒：原理和注意事项
质粒提取之达人建议碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。
追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。
这是导致我的学生误入歧途的主要原因。
后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。
这就不得不让人感到悲哀了。
我想这恐怕和我们的文化有点关系。
中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。
经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。
所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。
如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。
生命科学是实验科学，它讲究动手。
如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。
一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。
每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理是利用碱性溶液将细菌细胞膜溶解，从而释放出质粒。
具体步骤如下：
1. 首先，培养含有目标质粒的细菌菌株，并收集足够数量的细菌细胞。
2. 将细菌细胞离心沉淀，去除上清液。
3. 使用含有碱性成分的溶液，如含有氢氧化钠和EDTA的碱
裂解液，将细菌细胞重悬。
4. 碱性溶液中的氢氧化钠会破坏细菌细胞膜的完整性，并且EDTA会螯合钙离子，进一步增强细菌细胞膜的脆弱性。
5. 经过一定时间的碱裂解作用，细菌细胞膜将被溶解，质粒被释放出来。
6. 使用中性化溶液，如盐酸或磷酸，可以调整溶液的酸碱度，使其接近中性，从而停止碱裂解的作用。
7. 利用离心的方法，将碱裂解液中的细菌残渣和其他杂质分离，得到含有质粒的上清液。
8. 最后，可通过柱层析等方法对上清液进行纯化，以获取纯净的质粒。
这种碱裂解法提取质粒的原理是利用碱性溶液破坏细菌细胞膜，从而释放出质粒。
与其他提取方法相比，这种方法简单易行，成本低廉，并且适用于大规模提取质粒。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
碱裂解法抽提质粒的原理
碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。
溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。
因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。
乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
注意不要振荡。
将离心管放置于冰上5分钟。
注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。
细菌质粒提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取细菌质粒的原理和操作步骤。
2. 了解质粒DNA在分子生物学研究中的应用。
3. 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理质粒是细菌细胞内的一种小型、环状、双链DNA分子，独立于细菌染色体之外。
质粒携带的基因可以赋予细菌额外的生理代谢能力，如抗生素耐药性等。
碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法，其原理如下：1. 在碱性条件下，蛋白质与DNA发生变性，质粒DNA与染色体DNA分开。
2. 加入盐溶液使pH值恢复至中性，质粒DNA迅速复性，而染色体DNA不易复性，形成网状结构。
3. 通过离心，将质粒DNA与蛋白质、染色体DNA等杂质分离。
三、实验材料与仪器1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量移液器、紫外灯、凝胶成像系统、电泳仪、凝胶制备装置等。
2. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、NaOH溶液、SDS溶液、KAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA Marker、染色剂等。
3. 菌种：含质粒的大肠杆菌菌株。
四、实验步骤1. 菌液的制备：将含质粒的大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2. 收集菌体：取适量培养液，4000r/min离心2min，收集菌体。
3. 菌体裂解：向菌体中加入NaOH和SDS溶液，65℃水浴10min，使蛋白质与DNA变性。
4. 质粒DNA的纯化：向裂解液中加入KAc溶液，混匀后4℃静置10min，使质粒DNA沉淀。
5. 离心：4000r/min离心10min，收集沉淀。
6. 洗涤：向沉淀中加入70%乙醇，混匀后4℃静置10min，再次离心，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀干燥至完全无水。
8. 溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，溶解质粒DNA。
9. 琼脂糖凝胶电泳检测：取适量质粒DNA溶液，加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，质粒DNA在凝胶上呈现清晰的单一条带，表明质粒DNA已成功提取。
碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
碱裂解法小量提取质粒DNA
碱裂解法小量提取质粒DNA碱裂解法小量提取质粒DNA一、【实验原理】碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们，E.Coli染色体约4700Kb，SDS 是一种阴离子表面活性剂，它和NaOH共同作用既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来，基因组DNA断裂为线性双链片段，而质粒DNA仍为超螺旋，释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性，基因组DNA全部完全变性，而质粒DNA只有部分变性，然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA为小分子，两条互补链复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等通过离心一起沉淀下来而被除去。
然后通过苯酚、氯仿等抽提蛋白，2倍体积无水乙醇或0.6倍体积异丙醇沉淀DNA，70％酒精洗后，干燥，用无菌的双蒸水或TE溶解，－20℃保存。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动。
由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。
碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
碱裂解法原理及步骤总结
实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。
该方法提取质粒DNA是基于
线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的的。
在pH12.0~ 12.5的碱性条件下,染色体线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开;共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
当pH调至中性并在高盐及低温条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA留在上清中,然后用有机溶剂酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
●是基于线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的
●在pH12.0~12.5的碱性条件下
●细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋
结构被破坏而发生变性。
●共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态
●pH调至中性并在高盐条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS
的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态
三种溶液
平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大
量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了
醋酸：
是为了中和NaOH
75%酒精：
主要是清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强
酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
步骤
具体步骤参见对应试剂盒
DNA提取基本步骤：
●材料准备
●破碎细胞或包膜——内容物释放
●核酸分离纯化
●沉淀或吸附核酸,并去除杂质
●溶解核酸于缓冲液或水中。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA二、实验原理先以低速离心从培养液中收集菌体，带有质粒的细菌经EDTA破坏外膜后，由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性崩解而使胞内DNA全部释放出来。
利用染色体DNA与质粒DNA在强碱条件下变性与复性的差异分离质粒DNA。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液将pH值调节至中性时，变性的质粒DNA 会恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
用等体积饱和酚或氯仿使沉淀变性的蛋白质和染色体分离，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA。
②氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
③溶液I(pH8.0)：终浓度需称/量取葡萄糖 50mmol/L； C6H12O6.H2O 1.982 gEDTA 10mmol/L； 0.5mol/L 4 mLTris-HCl（PH8.0） 25mmol/L； 1mol/L 5 mL 加DDW定容至200ml，高压灭菌后于4℃保存备用。
④溶液II(pH12.5)：NaOH 0.4mol/L；称取1.6g，加DDW定容至100mlSDS 2%（W/V）；称取2.0g，加DDW定容至100ml室温存放，临用时将二者对半混匀即可。
⑤溶液Ⅲ(pH4.8)：100ml5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5mlDDW 28.5ml高压灭菌后于4℃保存备用。
⑥TE(pH8.0)：Tris-HCl（PH8.0） 10mmol/LEDTA（PH8.0） 1mmol/L⑦TE+R:1mlTE+5ulRNase⑧溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl (pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃⑨ 3mol/ L NaAc (pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
PCR (聚合酶链反应，polymerase chain reaction) 是一种可以在体外放大特定DNA
片段的技术，也称为扩增（amplification）技术。
PCR法可以有效地检测和扩增DNA片段。
该方法被用来在受检实体中提取、检测、识别和检测DNA多样性。
质粒可以通过PCR线性化来提取，也就是说，可以使用多个特异性引物（特异性对特
定片段的DNA的结合）及特定的片段的DNA作为模板，以获得一条目标片段（目标片段）。
碱裂解特定质粒原理是利用酵素将核酸中几个碱基分解，从而模拟碱基降解，如激酶
能够代表核酸序列几个碱基中的某一碱基。
碱裂解法检测质粒的方法通常用PCR技术来实现，这是因为扩增的方式允许在给定片段的碱基顺序上获得更高的灵敏度和特异性。
碱裂解能够确定质粒的结构，利用一种叫做“碱裂解”的方式，这种方式可以将一段DNA拆分成其他的片段，从而了解其结构，增强检测能力。
碱裂解技术包括酶具（如酶切酶），这些对特定碱基序列特异性，可以用来解析特定质粒，检测出质粒中特定载荷裂解
了的区域片段，以及分析质粒的尺寸。
通过PCR与碱裂解技术，可以高效提取质粒，检测其结构，从而改善生物体的检测以
及疾病的治疗。
此外，碱裂解技术还可以进一步改善基因密码的加密状态，以及鉴定新的
质粒结构。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了,几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因,我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤,而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因。
后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多,甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了
我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书,学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说,你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住,考试的时候能拿高分,这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化,那么科学是不能在中国真正扎根的,它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学,它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了,那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了?或者听听体育老师的讲解就会滑冰了?可是光动手不思考,不就成了一个工匠?一个合格的生命科学研究者,需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者,是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学,希望你看本文后能有所思考,让中国的未来有希望
为了方便理解,这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液:
溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0;
溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS;
溶液III,3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸
让我们先来看看溶液I的作用任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液,是再自然不过的了那么50 mM葡萄糖
是干什么的呢?说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响,所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢?大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是:抑制DNase的活性,和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA,无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二
价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢?实话告诉你,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
轮到溶液II了这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提事实上NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致用了不新鲜的0.4 N NaOH,即便是有SDS也无
法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下),自然就难高效率抽提得到质粒如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS 也是碱性的,只是弱了点而已很多人
对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致有人不禁要问,既然是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫这一步要记住两点:第一,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合(象对待女孩子一样),不然基因组DNA也会断裂基因组DNA的断裂会带来麻烦,后面我再详细说明
每个人都知道,溶液III加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉
淀的本质最容易产生的误解是,当SDS碰到酸性后发生的沉淀如果你这样怀疑,往
1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看。
大量沉淀的出现,显然与SDS的加入有关系如果在溶液II中不加SDS 会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然是
盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀,那会不会是遇盐
发生的沉淀呢?在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度
下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS 的沉淀。
但如果你加入的不是
NaCl而是KCl,你会发现沉淀的量要多的多这其实是十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀如此看来,溶液III加入后的沉
淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀。
更完全大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一
个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢?是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条
件会打断DNA,所以要中和之基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然
最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓
的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了,这是天大的误会,因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的,DNA分子的变性其实是个副产物,与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液III
加入并混合均匀后在冰上放置,目的是为了PDS沉淀更充分一点
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了,其实还有很多蛋白质不
能被沉淀,因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定
的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的
酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的,这里做个全面的介绍酚(Phenol)对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液(比如
4M的异硫氰酸胍),离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行至于异戊醇的添加,其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收
回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几
分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来这时候如果放到-20,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子,
因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀,就用70%的乙醇多洗几次,每次在室温放置一个小时以上,并用tip将沉淀打碎,就能
得到好的样品得到的质粒样品一般用含RNase(50 ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下你能看到三条带,但千万不要认
为你看到的是超螺旋线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样其实这三条带以电泳速度的快慢而排序,分别是超螺旋开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是20-
100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断非常偶然的是,有时候抽提到的质粒会有7-10
条带,这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致这里暂不深究。