生物制药 发酵工程制药

（二）灭菌方法
• 1、加热法 2、化学法 3、辐射法
4、过滤法
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（三）灭菌的矛盾之处
对杀灭细菌的同时
• 1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和 破坏。
• 2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。
（四）具体的灭菌技术
• 可分为6种技术：
• 1、间歇灭菌法 • 2、加热灭菌法 • 3、连续灭菌法 • 4、空气加热灭菌法 • 5、空气过滤灭菌法 • 6、营养物质瞬时高温杀菌法
• 不同温度下的空气细菌存活时间：
200℃/15.1s， 250℃/5.1s，
300℃/2.1s，
350℃/1.05s。
• 干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预 热到60-70℃，然后进入压缩机压缩，并在200℃ 以上的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后 再进入发酵罐之中。
5：空气过滤灭菌法
发酵后处理
(1)过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂 并降温
(2)提炼用溶媒萃取法。将发酵滤液酸化至pH=2，加 1/3体积的醋酸丁酯，混合后以碟片式离心机分离， 得一次BA提取液。然后以1.3 %～1.9 % NaHCO3在 pH 6.8～7.1条件下将青霉素从BA中提取到缓冲液 中。再调pH至2.0，将青霉素从缓冲液再次转入到 BA中，方法同上，二次BA提取液。
生产流程
青霉素发酵工艺
• （Ⅰ）种子制备 • （Ⅱ）发酵过程 • （Ⅲ）发酵后处理
种子制备
• 种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培 养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。 青霉素采用三级发酵，其目的是让青霉菌菌体数 量逐步扩大和适应过程，其次使发酵罐能连续使 用，以缩短生产周期。
• 一级种子发酵：发芽罐， • 二级发酵罐：繁殖罐， • 三级发酵罐：生产罐。
（三）pH 合成的适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0，青霉 素在碱性条件下不稳定，易水解。缓冲能力弱的 培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中 间产物积累。pH上升，加糖率过低不足以中和蛋 白产生的氨或其他生理碱性物质。前期pH控制在 5.7-6.3，中后期pH控制6.3-6.6，通过补加氨水 进行调节。pH较低时，加入CaCO3、通氨调节或提 高通气量。pH上升时，加糖或天然油脂。一般直 接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。
发酵过程
影响青霉素发酵产率的因素有环境因素，如pH值、 温度、溶氧饱合度、碳氮组份含量等；有生理变量 因素，包括菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态等， 对它们都要进行严格控制。
(一)青霉素发酵生产培养基 1、碳源 目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化
液进行流加。 2、氮源 可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉
发酵工程制药
张忠山
第六节 灭菌技术
• 灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵 系统。
• （一）灭菌项目 • （二）灭菌方法 • （三）灭菌的矛盾之处 • （四）具体的灭菌技术
（一）灭菌项目
• 1、在投入生产之前，必须对设备、管道 进行彻底清洗、和严格灭菌。
• 2、对通入的培养基、通入的空气进行先 行灭菌。
青霉素钠盐结晶析出，过滤，将晶体洗涤后进行干燥得成 品。可在60℃，20mmHg真空中烘16 h，然后磨粉、装桶。
二、氨基酸发酵生产
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是人体及 动物的重要营养物质。谷氨酸是一种重要的 氨基酸。我们就以谷氨酸的发酵生产为例简 单介绍一下氨基酸的发酵生产。
(一)谷氨酸发酵生产的菌种
隧道灭菌箱设备
3：连续灭菌法
• （1）定义 • （2）技术分类 • （3）连续灭菌法的优点 • （4）连续灭菌法的不足
（1）定义
• 连续灭菌法是指灭菌的操作的加热、保温 维持、冷却这三个过程，在同一时间内进 行。
• 因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置 加热设备、保温维持设备、冷却设备。
（2）技术分类
• 是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中 所含的微生物，取得无菌空气的目的。 空气过滤分为2种：
（1）绝对过滤 （2）深层过滤
•陶瓷过滤机
（1）绝对过滤
• 如超滤膜过滤就属于绝对过滤
• 是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗 粒。从而把颗粒截留。
（2）深层过滤
• 是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方 法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗 粒。这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。
（四）溶氧 溶氧＜30％饱和度，产率急剧下降，低于10％，
则造成不可逆的损害。所以不能低于30％饱和溶 氧浓度。通气比一般为1:0.8VVM。溶氧过高，菌 丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响 生产能力的发挥。适宜的搅拌速度，保证气液混 合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同， 对搅拌转速调整。
• 深层过滤所用的过滤介质-------棉花、活性碳、 玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结 材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃 尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃 纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、 PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应 用）。
6：营养物质瞬时高温杀菌法
• 每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值
（五）消沫
• 发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂： 玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在 前期多加入，影响呼吸代谢。
• 青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2h取样一 次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙 酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检 查，发现染菌立即结束发酵，视情况放过滤提取， 因为染菌后pH值波动大，青霉素在几个小时内就 会被全部破坏。
• （Ⅲ）容易实现自控操作。 • （Ⅳ）能够避免系统的反复加热和冷却，
可提高热利用率。是目前很多制药厂经常 采用的方法。
（4）连续灭菌法的不足
• A、投资较大，
• B、需要同时设置加热、冷却装置。
4：空气加热灭菌法
• 利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的 蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空 气加热灭菌法。
• 常用于保藏基因工程菌。
6、冷冻真空干燥法 菌液加保护剂，冷冻真空干燥，保藏5-15年。
7、液氮法 菌液加保护剂置于液氮，保存15年以上。
8、宿主保藏法 适用于专性活细胞寄生微生物，连同被感染 的宿主一同低温保藏。
第八节 工业发酵的主要产品
一、抗生素发酵生产
抗生素是生物体在生命活动中产生的一种次级代谢产 物。这类有机物质能在低浓度下抑制或杀灭活细胞，这 种作用又有很强的选择性。抗生素主要用微生物发酵法 生产，少数抗生素也可用化学方法合成，人们还对天然 得到的抗生素进行生化或化学改造，使其具有更优越的 性能，这样得到的抗生素叫半合成抗生素，其数目已达 到两万多种。抗生素不仅广泛用于临床医疗，而且已经 用于农业、畜牧及环保等领域。
青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生 素，1928年为英国人A . Fleming发现，40 年代投入工业生产。在二战期间立刻大显 身手，它能有效控制伤口的细菌感染，挽 救了数百万战争中受伤者的性命。我们就 以青霉素为例简单介绍抗生素的发酵生产 过程。
青霉素发酵生产菌株
最初由弗莱明分离的点青霉，只能产生2 U／ml的 青霉素。目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大 都由菌株Wis Q l76(一种产黄青霉)经不同改良途径 得到。70年代前育种采用诱变和随机筛选方法，后来 由于原生质体融合技术、基因克隆技术等现代育种技 术的应用，青霉素工业发酵生产水平已达85 000U／ ml以上。青霉素生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下 保存其分生孢子，也可以用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂， 在－70度冰箱或液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体。
• 连续灭菌法可以分为2种：
• （Ⅰ）加热、冷却缓慢交替进行方法。
• （Ⅱ）迅速升温+闪急冷却方法-----这种 方法称为HTST方法，这对于保证营养物质 极为有利。
（3）连续灭菌法的优点
• （Ⅰ）可减少培养剂中营养物质的损失、 提高产物收率。
• （Ⅱ）由于操作条件恒定，可以获得稳定 的灭菌质量。
或麸质粉，并补加无机氮源。
3、前体 苯乙酸或苯乙酰胺，由于它们对 青霉菌有一定毒性，故一次加入量不能 大于0.1％，并采用多次加入方式。
4、无机盐 包括硫、磷、钙、镁、钾等 盐类，铁离子对青霉菌有毒害作用，应 严格控制发酵液中铁含量在30ug／ml以 下。
（二）温度
生长适宜温度30℃，分泌青霉素温度20℃。但 20℃青霉素破坏少，周期很长。生产中采用变温 控制，不同阶段不同温度。前期控制25－26℃左 右，后期降温控制23℃。过高则会降低发酵产率， 增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的 转化得率。有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较 高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低 温度，以利于青霉素合成。
（2）注意事项
• 应当避免过长的加热时间，否则常常会破 坏培养基中的营养物质。
• 系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个 杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，1个 杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整 批发酵液的失败。
（3）间歇灭菌法的优点
• 设备造价低廉。 • 便于进行手动操作。
2：加热灭菌法
• 一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增 加>>营养物质遭到破坏的速率。
• 因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营 养物质则破坏得不多。
• 根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌 法进行杀菌操作。
第七节 菌种保藏
目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性
原理
以尽量延长使用时间
(3)脱色 在二次BA提取液中加活性炭150-300g／10亿单位，脱 色、过滤。
(4)结晶 用丁醇共沸结晶法。将二次BA萃取以0.5 mol/L NaOH 液萃取，调pH至6.4～6.8，得青霉素钠盐水浓缩液。加3～4 倍体积的丁醇，在16～26℃，5～10 mmHg下真空蒸馏，将水 与丁醇共沸物蒸出，并随时补加丁醇。当浓缩到原来水浓缩 体积，蒸出馏分中含水达2％～4％时，即停止蒸馏。
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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缺营养
低温
不利 条件
无氧
干燥
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细菌保藏方法：
• 斜面低温法 • 石蜡油封存法 • 沙土管保藏法 • 麸皮保藏法 • 甘油悬液保藏法 • 冷冻真空干燥保藏法 • 液氮超低温保藏法 • 宿主保藏法
1、斜面低温法
• 优点： ---简便易行，成活率高
缺点： ---不适用于对干燥敏感的细菌和酵母
4、麸皮保藏法
基质的处理
麦粒浸透、煮熟 麸皮拌湿
装管
灭菌 接种 培养 干燥器去水
特点
防衰老 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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5、甘油保藏法
• 对数生长期细菌与灭菌甘油混合，使甘油 终浓度为10%--15%，分装置于低温冰箱， -20℃可保存1年，-70℃可保存10年以上。
谷氨酸发酵生产菌种主要有棒状杆菌属、短杆菌 属、小杆菌属及节杆菌属的细菌。除节杆菌外， 其他三属中有许多菌种适用于糖质原料的谷氨酸 发酵。这些细菌都是需氧微生物，都需要以生物 素为生长因子。我国谷氨酸发酵生产所用菌种有 北京棒状杆菌AS1299、钝齿棒状杆菌AS1542、 HU7251及7338、B9等。这些菌株的斜面培养一般 采用由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠等组成，pH为 7.0～7.2的琼脂培养基，32 ℃培养24 h，冰箱保 存备用。
1：间歇灭菌法
• 又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵 罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。
• （1）灭菌方法 • （2）注意事项 • （3）间歇灭菌法的优点
（1）灭菌方法
• 间歇灭菌的操作过程分为3个过程：
• 加热----保温维持----冷却。
• 这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。 然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是 主要的，冷却杀菌的作用最小。
• 缺点： --- 保藏期短，传代次数多，易变异和污染
2、石蜡油封存法 灭菌液体石蜡
4℃，1-2年 低温、阻氧
不适合分解烃类细菌
3、 沙土管保藏 干净无菌沙土 混匀 菌悬液 沙土管 抽真空 封口低温保藏（1-10年）
优点： ---具有低温、干燥、阻氧、无营养物的特点 ---保藏期长（1-10年），效果好 ---微生物移接方便，简单经济 ---较适用于产孢子以及形成芽孢的微生物