分子生物学基础PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2. 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的 污染应降低到最低程度
3. 排除其它核酸分子的污染（如DNA中的RNA）
2020/10/30
8
Part I Isolation of nucleic acid
操作过程中应注意的事项
尽量简化操作步骤 缩短提取过程，以减少各种有 害物质对核酸的破坏
减少化学因素对核酸的降解 为避免过酸、过碱对 核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作应在pH4～10之间 进行。
6 M NaCl
2020/10/30
18
基因组DNA的提取
二、高盐法（操作步骤）
1. 50 mg新鲜组织，加液氮研磨成粉，加入400 l 抽提缓冲取，蛋 白酶K至400 g/ml，充分混匀，55～65℃保温2 h，中途混匀 几次。
2020/10/30
11
Part I Isolation of nucleic acid
核酸提取的主要步骤
1. 破碎细胞 2. 去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类大
分子 3. 去除其它不需要的核酸 4. 沉淀核酸 5. 去除盐类、有机溶剂等杂质。
2020/10/30
12
基因组DNA的提取
酚抽提法
试剂
DNA提取缓冲液（抽提buffer, STE）10mM Tris-HCl（pH8.0）；0.1M EDTA；20ug/ml 胰RNA酶；0.5%SDS
蛋白酶K
Tris-HCl(0.5M, pH8.0)饱和酚
10M NH4Ac、乙醇、TE
2020/10/30
13
基因组DNA的提取
一、酚抽提法
2020/10/30
15
基因组DNA的提取
一、酚抽提法
操作步骤
4. 沉淀 上层粘稠水相至一新管，加入2倍体积的无水 乙醇（0.2倍体积的10M NH4Ac），室温下缓慢混匀， 即可见乳白色丝状DNA沉淀。10000g, 10min。上层 乙醇移入一新管暂时保存
5. 洗盐 沉淀中加入2倍体积的70%乙醇，漂洗2次， 5000g，5min。弃上清。
2020/10/30
6
Part I Isolation of nucleic acid
核酸分离提取的总原则
1. 保证核酸一级结构的完整性。
2. 排除其它分子的源自文库染
2020/10/30
7
Part I Isolation of nucleic acid
核酸分离纯化应达到的要求
1. 样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子
昆虫学实验技术
－分子生物学基础
2020/10/30
1
DNA分离
RNA分离
质量鉴定 浓度测定
质量鉴定 浓度测定
cDNA合成
引物设计 合成
PCR
PCR
电泳检测
基因克隆基本流程图
克隆、测序
2020/10/30
2
主要内容
Part 1 Isolation of nucleic acid Part 2 Synthesis of complementary DNA (cDNA) Part 3 PCR(Polymerase chain reaction) Part 4 Cloning and sequencing of PCR product Part 5 Basis of bioinfomatics
操作步骤 1. 样品制备 昆虫组织：匀浆 液氮研磨 动物血液：于新鲜血液中按6:1加入ACD抗凝液后可 于0℃保存数天或于－70℃长期保存。1300g， 15min，弃上清，将下层淡黄色移到新离心管中， 重复离心一次，弃上清，将下层白细胞用STE悬浮。
2020/10/30
14
基因组DNA的提取
DNA ：
细胞核：95%， 各种细胞器：5%
RNA：
主要存在于细胞质中，约占75%， 细胞核：10% 各种细胞器中15% 。
2020/10/30
5
Part I Isolation of nucleic acid
RNA中以rRNA最多，80～85%， tRNA及核内小分子RNA占10～ 15%，mRNA只占1～5%。
2020/10/30
16
基因组DNA的提取
一、酚抽提法
操作步骤 6. 干燥 室温下放置5～10min，使乙醇挥发，注意不要 使DNA完全干燥。 7. 溶解 加入适当体积的TE溶解。
8. 保存 4℃。于-70℃可保存5年以上。
2020/10/30
17
基因组DNA的提取
二、高盐法
试剂
抽提缓冲液：TNES buffer 10mM Tris-HCl, pH8.0; 400mM NaCl; 100mM EDTA, 1%SDS)
2020/10/30
10
Part I Isolation of nucleic acid
操作过程中应注意的事项
防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶可以
消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中 DNA酶的激活需要二价金属离子Mg2+和Ca2+的存在。可以通 过使用螯合剂如EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸盐等来抑制 DNA酶的活性。RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高 温、耐酸、耐碱，不易失活，因此对完整RAN的提取危害极大。
2020/10/30
9
Part I Isolation of nucleic acid
操作过程中应注意的事项
减少物理因素对核酸的降解 主要有剪切力和高温。
强力高速的溶液振荡、搅拌，DNA样品的反复冻融等机械剪切 力主要危害分子量较大的线性DNA分子，对分子量较小的环状 质料DNA和RNA分子等的危害相对小一些。高温对核酸分子中 的某些化学键也有破坏作用，因此核酸提取的常规操作温度为 0～4℃，低温可以降低核酸酶的活性和反应速率，从而减少对 核酸的生物降解。
2020/10/30
3
Part I Isolation of nucleic acid
核酸的存在形式：与蛋白质结合 核酸的形状：
双链线状：
双链环状：
单链环状：
单链线性：
AAAAA
2020/10/30
4
Part I Isolation of nucleic acid
真核生物中核酸的含量：
一、酚抽提法
操作步骤 2. 消化 将上述含有样品的STE于37℃保温1h，再加入蛋 白酶K至100ug/ml，50～55℃保温1～3 h，不时轻摇反 应液。
3. 抽提 冷却至室温，加入等体积Tris饱和酚，温和转动 离心管使两相混匀，反复10min。离心，10000g, 10min。转移上层粘稠水相至一新管，重复抽提2次。
3. 排除其它核酸分子的污染（如DNA中的RNA）
2020/10/30
8
Part I Isolation of nucleic acid
操作过程中应注意的事项
尽量简化操作步骤 缩短提取过程，以减少各种有 害物质对核酸的破坏
减少化学因素对核酸的降解 为避免过酸、过碱对 核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作应在pH4～10之间 进行。
6 M NaCl
2020/10/30
18
基因组DNA的提取
二、高盐法（操作步骤）
1. 50 mg新鲜组织，加液氮研磨成粉，加入400 l 抽提缓冲取，蛋 白酶K至400 g/ml，充分混匀，55～65℃保温2 h，中途混匀 几次。
2020/10/30
11
Part I Isolation of nucleic acid
核酸提取的主要步骤
1. 破碎细胞 2. 去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类大
分子 3. 去除其它不需要的核酸 4. 沉淀核酸 5. 去除盐类、有机溶剂等杂质。
2020/10/30
12
基因组DNA的提取
酚抽提法
试剂
DNA提取缓冲液（抽提buffer, STE）10mM Tris-HCl（pH8.0）；0.1M EDTA；20ug/ml 胰RNA酶；0.5%SDS
蛋白酶K
Tris-HCl(0.5M, pH8.0)饱和酚
10M NH4Ac、乙醇、TE
2020/10/30
13
基因组DNA的提取
一、酚抽提法
2020/10/30
15
基因组DNA的提取
一、酚抽提法
操作步骤
4. 沉淀 上层粘稠水相至一新管，加入2倍体积的无水 乙醇（0.2倍体积的10M NH4Ac），室温下缓慢混匀， 即可见乳白色丝状DNA沉淀。10000g, 10min。上层 乙醇移入一新管暂时保存
5. 洗盐 沉淀中加入2倍体积的70%乙醇，漂洗2次， 5000g，5min。弃上清。
2020/10/30
6
Part I Isolation of nucleic acid
核酸分离提取的总原则
1. 保证核酸一级结构的完整性。
2. 排除其它分子的源自文库染
2020/10/30
7
Part I Isolation of nucleic acid
核酸分离纯化应达到的要求
1. 样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子
昆虫学实验技术
－分子生物学基础
2020/10/30
1
DNA分离
RNA分离
质量鉴定 浓度测定
质量鉴定 浓度测定
cDNA合成
引物设计 合成
PCR
PCR
电泳检测
基因克隆基本流程图
克隆、测序
2020/10/30
2
主要内容
Part 1 Isolation of nucleic acid Part 2 Synthesis of complementary DNA (cDNA) Part 3 PCR(Polymerase chain reaction) Part 4 Cloning and sequencing of PCR product Part 5 Basis of bioinfomatics
操作步骤 1. 样品制备 昆虫组织：匀浆 液氮研磨 动物血液：于新鲜血液中按6:1加入ACD抗凝液后可 于0℃保存数天或于－70℃长期保存。1300g， 15min，弃上清，将下层淡黄色移到新离心管中， 重复离心一次，弃上清，将下层白细胞用STE悬浮。
2020/10/30
14
基因组DNA的提取
DNA ：
细胞核：95%， 各种细胞器：5%
RNA：
主要存在于细胞质中，约占75%， 细胞核：10% 各种细胞器中15% 。
2020/10/30
5
Part I Isolation of nucleic acid
RNA中以rRNA最多，80～85%， tRNA及核内小分子RNA占10～ 15%，mRNA只占1～5%。
2020/10/30
16
基因组DNA的提取
一、酚抽提法
操作步骤 6. 干燥 室温下放置5～10min，使乙醇挥发，注意不要 使DNA完全干燥。 7. 溶解 加入适当体积的TE溶解。
8. 保存 4℃。于-70℃可保存5年以上。
2020/10/30
17
基因组DNA的提取
二、高盐法
试剂
抽提缓冲液：TNES buffer 10mM Tris-HCl, pH8.0; 400mM NaCl; 100mM EDTA, 1%SDS)
2020/10/30
10
Part I Isolation of nucleic acid
操作过程中应注意的事项
防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶可以
消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中 DNA酶的激活需要二价金属离子Mg2+和Ca2+的存在。可以通 过使用螯合剂如EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸盐等来抑制 DNA酶的活性。RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高 温、耐酸、耐碱，不易失活，因此对完整RAN的提取危害极大。
2020/10/30
9
Part I Isolation of nucleic acid
操作过程中应注意的事项
减少物理因素对核酸的降解 主要有剪切力和高温。
强力高速的溶液振荡、搅拌，DNA样品的反复冻融等机械剪切 力主要危害分子量较大的线性DNA分子，对分子量较小的环状 质料DNA和RNA分子等的危害相对小一些。高温对核酸分子中 的某些化学键也有破坏作用，因此核酸提取的常规操作温度为 0～4℃，低温可以降低核酸酶的活性和反应速率，从而减少对 核酸的生物降解。
2020/10/30
3
Part I Isolation of nucleic acid
核酸的存在形式：与蛋白质结合 核酸的形状：
双链线状：
双链环状：
单链环状：
单链线性：
AAAAA
2020/10/30
4
Part I Isolation of nucleic acid
真核生物中核酸的含量：
一、酚抽提法
操作步骤 2. 消化 将上述含有样品的STE于37℃保温1h，再加入蛋 白酶K至100ug/ml，50～55℃保温1～3 h，不时轻摇反 应液。
3. 抽提 冷却至室温，加入等体积Tris饱和酚，温和转动 离心管使两相混匀，反复10min。离心，10000g, 10min。转移上层粘稠水相至一新管，重复抽提2次。