抗结核分支杆菌药物筛选模型

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以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物

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中国抗生素杂志２００７年７月第３２卷第７期
・３１・９
文章编号：（］－６９２０）７０９－５１）１８８（０７０ —３１０（
以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物
中图分类号：７．Ｒ９８３文献标识码：Ａ
Ｉｏｉｒｔｙｓｓｃｔａｅｌａｅ，ａｎｅｔｒｅｎａｔ— ｕｅｃｌｓｓｄｕｇｒｓａｃｗａｇｔｉｎｉｔｂｒｕｏｉｒｅｅｒｈ
ＷａｇＹａｇａｄＸｉｏＣｈｕｌｎｎｎｎａｎ—ｉｇ
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抗结核天然药物筛选的巨噬细胞模型研究

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关于200株结核菌药敏试验的结果分析

关于200株结核菌药敏试验的结果分析发表时间：2019-01-08T09:23:59.513Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2018年7月下第14期作者：王森[导读] 观察200株结核菌药敏试验的结果分析。

方法：选取200株结核分支杆菌，对200株结核分支杆菌均进行INH、SM、EMB以及RFP四种抗结核药物的药敏试验，并分析试验结果。

结果：200株结核分支杆菌中王森广西桂林全州县疾病预防控制中心 541500【摘要】目的：观察200株结核菌药敏试验的结果分析。

方法：选取200株结核分支杆菌，对200株结核分支杆菌均进行INH、SM、EMB以及RFP四种抗结核药物的药敏试验，并分析试验结果。

结果：200株结核分支杆菌中，共有141株药物对于四种抗结核药物全部敏感，共有76株对1种或1种以上药物耐药；76株药物中，对于抗结核药物的频次高低依次为耐INH、耐REP、耐SM以及耐EMB。

结论：结核分支杆菌对于多种药物均具有一定的耐药性，在临床用药中，需要根据患者的实际情况以及药敏试验结果合理选择药物。

【关键词】结核分支杆菌；药敏试验；抗结核杆菌高耐药率与耐多药菌株的扩散，现已经成为了结核病控制中的主要问题。

因此，为充分了解结核菌的耐药情况，研究耐药性的发展趋势[1]。

本次研究了200株结核分支杆菌，分析了200株结核分支杆菌药敏试验结果，具体报告如下：一、资料与方法1.1 一般资料收集了2015年1月至2018年10月筛选的200株结核分支杆菌。

标准菌株（H37Rv）、抗结核药物纯品；链霉素（SM，S）、异烟肼（INH，H）、利福平（RFP，R）以及乙胺丁醇（EMB，E）；患者的总例数为200例，其中男性患者118例，女性患者82例；患者的年龄在26～48岁，平均年龄（37.25±6.13）；初次治疗的患者共有147例，复诊治疗的患者的共有53例。

1.2 研究方法培养方式：所有样本均采用痰抗酸杆菌图片，对所有涂片样本均采用L-J培养基进行结核分支杆菌分离培养。

结核分枝杆菌药敏试验分析

１３２１ＴＨ、ＫＭ、ＣＰＭ）总耐药率为４２．７％，其中耐多药结核分枝杆菌菌株占３０．２％。从结果看出，在国家防痨规划的抗结
公司生产。结核分枝杆菌药敏培养基（比例法）由广州凯升生物科技有限公司生产。
果９６例药敏试验中，结核分枝杆菌总耐药菌株为４１例，总耐药率为４２．７％，其中耐多药菌株２９株，耐药率为３０．２％。结论
复治。
本市结核患者已出现耐药趋势，且有向耐多药发展，而在没有出现更有效新药替
代已产生耐药的药物前，必须坚持科学合理的抗结核病药物治疗原则，从而减少传染性肺结核患者的
培养基，接种完毕置３７￣Ｃ恒温培养箱内培养。
１．２．２药敏试验
将所有培养出的阳性标本待测菌液制备
成１０～２ｇ／Ｌ和１Ｏ一４ｇ／Ｌ菌悬液，分别用２２ＳＷＧ标准接种环蘸取１环（即０．０１ｍ１）的菌液，用划线法将ｌＯ～２ｇ／Ｌ菌悬液均匀接种分别含异烟肼（ＩＮＨ）、利福平（ＲＦＰ）、链霉素（ＳＭ）、吡嗪酰胺（ＰＺＡ）、乙胺丁醇（ＥＭＢ）、对氨基水杨酸（ＰＡＳ）、丙硫异烟胺（１３２１ＴＨ）、卡那霉素（ＫＭ）、卷曲霉素（ＣＰＭ）药敏培养基表面，将ｌ０— ４ｇ／Ｌ菌悬液接种于对照培养基表面，应注意是菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。接

以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用

以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用周爽;蒙建洲;关艳;胡辛欣;司书毅;肖春玲【摘要】目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型，筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂，获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。

方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板，pET28a表达质粒为载体，将 alr 基因克隆至 pET28a ，构建pET28a：alr 重组表达质粒，表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶；通过测定反应产物 NADH 在340 nm处光密度变化速率，检测酶反应活性，构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型；应用该模型对化合物库进行筛选；测定活性化合物 IC50以及对结核分枝杆菌的 MIC。

结果成功构建了结核分枝杆菌 alr 基因的表达载体；得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶，测得该酶的比活力为13.53 kU/mg；所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高，符合高通量筛选的要求；通过对70000个化合物进行筛选，得到了5个活性较高的化合物，其中，IMB-XZ5对结核分枝杆菌的 MIC 为4~8μg/ml，且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。

结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型，应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。

%Objective To establish a high throughput screening (HTS) model targeting mycobacterium tuberculosis (MTB) alanine racemase (ALR) for the discovery of novel antitubercular drugs and to determine inhibitory activities against MTB of the inhibitors. Methods The H37Rv ALR coding gene alr was amplified and cloned into pET28a expression vector. The recombinant ALR was expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysSand its activity was measured by detecting the absorption at 340 nm wavelength. HTS model was established based on the activity of ALR and Z' factor was used to evaluate the quality of HTS model. About 70 000 compounds were screened using this model and the IC50 of inhibitors were determined. Inhibitory activities against H37Rv and some other bacteria strains of the inhibitors were also evaluated. Results Recombinant H37Rv alr vector was successfully constructed and expressed, with the optimal enzymatic activity of ALR being 13.53 kU/mg. The parameters suggested that this HTS model was highly stable and feasible for HTS drug screening. Of the 70 000 compounds, 5 compounds appeared inhibitory activities to ALR in this HTS model. The inhibitor IMB-XZ5 was determined active against H37Rv with the MIC 4-8μg/ml and the specificity was obvious. Conclusion A steady and sensitive HTS model for MTB ALR inhibitors was established. One of the ALR inhibitors was evaluated and has potential to become an active and specific anti-TB lead compounds.【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】8页(P116-123)【关键词】丙氨酸消旋酶;抗结核药;酶抑制剂;高通量筛选【作者】周爽;蒙建洲;关艳;胡辛欣;司书毅;肖春玲【作者单位】100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室;100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室;100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室;100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室;100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室;100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室【正文语种】中文方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板，pET28a表达质粒为载体，将alr 基因克隆至 pET28a，构建 pET28a::alr 重组表达质粒，表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶；通过测定反应产物 NADH 在 340 nm 处光密度变化速率，检测酶反应活性，构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型；应用该模型对化合物库进行筛选；测定活性化合物 IC50以及对结核分枝杆菌的 MIC。

药物化学中的抗结核病药物研究

药物化学中的抗结核病药物研究近年来，结核病作为一种严重威胁人类健康的传染病，引起了全球关注。

为了有效应对结核病的挑战，药物化学领域的科研人员致力于开发新的抗结核病药物。

本文将探讨药物化学中的抗结核病药物研究，介绍相关的药物设计和发现的方法、抗结核病药物的机制以及未来的发展方向。

一、药物设计和发现的方法在药物化学中，设计和发现抗结核病药物的方法是多样的。

其中，计算机辅助药物设计是一种常用的方法。

通过模拟药物与靶标之间的相互作用，科研人员可以预测药物的活性和选择性，从而指导合成和优化药物结构。

另外，天然产物也是药物发现中的重要资源。

科研人员通过筛选和提取具有潜在抗结核活性的天然产物，并对其结构进行修饰和优化，从而获得具有更好药效和安全性的化合物。

二、抗结核病药物的机制抗结核病药物的作用机制多种多样，如抑制细菌细胞壁合成、破坏细菌细胞膜、抑制蛋白质合成等。

以异烟肼为例，它能够通过抑制细菌的酯酶活性，干扰有丝分裂和RNA合成，从而对结核分枝杆菌起到杀菌作用。

传统的抗结核药物如利福平和吡嗪酰胺则主要通过干扰细菌细胞壁的合成，破坏细菌结构，从而有效抑制病菌生长和繁殖。

然而，由于结核分枝杆菌的突变和耐药性不断出现，传统抗结核药物正在受到严重威胁。

因此，寻找新的抗结核病药物机制和靶点是当务之急。

三、未来的发展方向随着科学技术的不断进步，药物化学中的抗结核病药物研究正朝着更具创新和高效性的方向发展。

其中，化学生物学的方法值得关注。

通过结合化学合成与生物学筛选技术，科研人员可以高通量地筛选和评估大量的化合物，从而加快抗结核药物的发现过程。

另外，基于药物代谢动力学和药物动力学的研究也逐渐受到重视。

了解药物在体内的代谢和药效动力学特性，可以更好地指导药物的合理用药和优化药物剂型，提高抗结核药物的疗效和减少不良反应。

此外，基于靶点和信号通路的研究也有望促进抗结核药物的开发。

科研人员可以通过对结核分枝杆菌的生物学过程和代谢途径的深入研究，寻找新的靶点，并设计具有高选择性和亲和力的药物分子。

应用Alamarblue检测细胞内药物抗结核分枝杆菌活性的研究

ｉｖｓｉａｅｔｉｎｅｔｄｍａｒｐａｅｙｔｅｃｌｒｅｒｃｍｅｈｄａｄｃｍｐｒｄｗｉｅｒｓｌｂａｎｄｆｏＵｏｎｎｅｔｔｄｗｉｎｉｆｃｅｃｏｈｇｓｂｏｏｉｔｉｔｏｎｏｇｈｈｍａｅｔｔｅｕｔｏｔｉｅｒｍＣＦｃｕｔＴｈｎｒｃｌｌｒｈｈｓｅｉｔａｅｌａｕ
ａｔｉｅｆｃｏａｉｉｅｄｒｖｔｅＭｅｈｄＴｈｐｉａＭＯＩｈｇｃｔｓｄｔｍｅａｄｄｕｘｏｕｅｉｅｅｓｌｃｅａｅｎｔｅｃｉｔｓｏｌｆｚｍｎｅｉａｉｓｖｉｖｔｏｓｅｏｔｌｍ，ｐａｏｙｏｅｉｎｒｇｅｐｓｒｄｔｍｅｗｒｅｅｔｄｂｓｄｏｈｂｃｅｉｍｏｎｎｔｅｔｄｍａｒｐａｅ，ｈｃｓｄｔｒｎｄｂａｔｒａａｕｔｒａｅｃｏｈｇｓｗｉｈｗａｅｅｍｉｅｙＣＦＵｃｕｔＴｈｃｉｉｅｆｓｍｅｃｍｍｏｌｓｄａｔｂｏｉｓｗｅｅｉｏｎ．ｅａｔｖｔｓｏｏｏｉｎｙｕｅｎｉｉｔｃｒ
对细胞内药物抗结核活性作出快速、客观的评价。
关键词药物筛选巨噬细ｌｅＡｓａｒＤｅｅｍｉｉｇｔｄｆＡｌｍａｕｓｙｆｔｒｎｎｏ
ｔｅＩｒｃｌａｔｖｔｆＮｅＡｎｔｔｅｃｌｒＤｒｇｈｎｔａｅｌｒＡｃｉｉｙｏｗｕｌｉｕｂｒｕａｕｓ

利用功能基因组学蛋白质组学筛选抗结核新药

１２微生物功能基因组可以发现新的作用机制美．
物［４２］－。ＩＩ微生物功能基因纽学有助于发现新靶点．药物发现的关键是药物作用靶点和化合物的选择。作为广谱抗生素的理想靶点应具备下列条件：微生物生存必需、在多种致病菌中高度保守、人体缺乏该靶点或即使存在该靶点也与微生物的该靶点有根本差异、已经在
芯片监渊ＭＴＢ对异烟肼（Ｎ反应的基因，现ＩＨＩＨ）发Ｎ
诱导表达的基因包括一个操纵子基因簇（５共个基因．编码 Ⅱ型脂肪酸合成酶及编码海藻糖二分枝酸酰基
步在其他基因组中确证。寻找致病菌基因组中高度保守的蛋白质（具高度保守氨基酸序列的蛋白，３其Ｄ
一
ｔｅ。ＤＡ芯片可用于发现参与感染致病的ｕｒ∞ ）Ｎｂｃ基因，体内表达技术（Ｅ）ＷＴ可以识别被宿主诱导表达的基因，因中断技术可以详细研究每个基因的功能。基组合化学库和高通量筛选技术结合，以大大降低药可物开发的成本。遗传工程技术可降低成本、大规模生产常规途径难以获得的可作为新药的生物活性分子。２０年２１００月０日，由洛克非勒基金和世界卫生组织等
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医药导报２０年３０２月第２卷第３１期
・１１・４
利用功能基因组学蛋白质组学等筛选抗结核新药
谢建平，军。王洪海乐，
（．１西南师范大学生命科学学院，重庆４０１；２上海市肺科医院，０３；０７５．２４３０３复旦大学生命科学学院，．上海２０３）０４３

抗结核药物筛选模型荧光素酶报告系统的建立

２１０２年第２卷第１８期
Ｖ０．８Ｎｏ１２１１２．０２
包
头
医
学
院
学
报
９
ＪＯＵ刚ＮＡＬＡｏＴｏＵＥＤＩｏＦＢＭＣＡＬＣＯＬＬＥＧＥ
抗结核药物筛选模型荧光素酶报告系统的建立
贾平平张义彭世泽岑山
核药物是目前急需解决的问题，而寻找抑制细菌生长
的活性化合物是目前抗结核药物研发的首要途径。现有抗结核的一线药物多数是通过抑制结核分枝杆菌生存所必需的环节抑菌或杀菌，而在药物产生的生存压
力下，结核分枝杆菌会通过各种方式来逃避药物的杀
较早的通过ＥＸ一１Ｓ分泌系统分泌的蛋白。ＣＰ一１Ｆ０的ｃ末端信号序列被Ｒ３７ｖ８１识别，者与膜蛋白后Ｒ３７结合，ｖ８０通过水解ＡＰ将其分泌至胞外。信号Ｔ序列位点的突变能够阻止ＣＰ —１的分泌。Ｆ０Ｊ
（．１包头医学院药学院，内蒙古包头０４６；１００２中国医学科学院医药生物技术研究所免疫生物学室）．
摘要目的：ＥＸ一１以Ｓ分泌系统为靶点，建立能够寻找既能抑制该系统发挥功能、降低结核菌毒力和细胞内生
存力，又不抑制分枝杆菌生长、减少耐药性产生可能性的抗结核药物。方法：过ＰＲ的方法扩增得到Ｌｃｅａｅ通Ｃｕｉｒｓｆ（Ｕ）ＣＰ一１ＬＣ、Ｆ０及其突变体ＡＦＣＰ一１，０应用搭桥的方法将二者融合，电击转化人海分枝杆菌，测定海分枝杆菌上清中

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【摘要】目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pC ANTA B5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6 ×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.%Aim: To construct a human phage-displayed single-chain Fv antibody (ScFv) library and screen specific ScFv against Mycobacterium Smegmatis. Methods: The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients with Mycobacterium Smegmatis, first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo ( dT) -18 primer. To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers, cDNA first strand as a template, were amplified H chain and L chain variable region genes. SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled into ScFv fragments and then cloned into pCANTAB5E ScFv vector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 get Mycobacterium Smegmatis single chain antibody phage display library. Results: A primary library of 3.5 X 106 and a second library of 2.6 x 106 were constructed. Conclusion: The results lay a solid foundation for preparation of human engineeringantibody to Mycobacterium Smegmatis reported herein with higher affinity.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2011(034)005【总页数】5页(P70-74)【关键词】结核杆菌;人源噬菌体单链抗体;制备及筛选【作者】何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【作者单位】贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起结核病的病原菌，也称结核杆菌.可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见.目前全球约有20亿肺结核带菌者，现症结核患者2 000万，每年有1 000万人新发病和300万人死亡.我国结核患者人数居世界第二位，全国1/3的人口曾受到结核菌的感染［1］.噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，各种小分子抗体相继产生，在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势.该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点［2］.本研究尝试利用噬菌体展示技术构建大容量天然人源性噬菌体抗体库，从中筛选出结核杆菌的人源性单链抗体(single chain Fv fragment，scFv)，为进一步研制抗结核杆菌的特异性的基因工程抗体奠定了基础.100 mL外周血来自10例康复1月的结核患者(遵义医学院附属医院检验科提供)，淋巴细胞分离液，购自上海华精生物高科技有限公司.总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司产品;DNA Purification System，Promega，公司产品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，购自大连宝生物公司;噬菌粒载体pCANTAB-5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌E.coli TG1、HRP/抗M13单克隆抗体，Amersham公司产品;结核杆菌抗原(批号:984010)，购自上海晶莹生物制品公司. 2.1 人源抗体VH和VL基因的PCR扩增以合成的cDNA为模板，VHf和VHr引物等物质的量混合扩增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物质的量混合液扩增VL基因.VL的PCR反应条件为:95℃预变性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min.VH的退火温度为65℃，其他反应条件同VL.PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的基因片段.2.2 ScFv基因的构建通过重叠延伸拼接法将VH和VL基因拼接成ScFv基因.取纯化的VH和VL基因片段经94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10个循环后，加含有酶切位点的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35个循环.PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收.2.3 噬菌体抗体库的构建将上述PCR产物ScFv纯化回收，用SfiⅠ和NotⅠ进行酶切，与经同样双酶切的表达载体pCANTAB5E用T4 DNA连接酶，电转化大肠杆菌TG1，铺SOBAG平板.用2×YTAG培养基洗脱菌落，稀释至A600=0.5，加入辅助噬菌体M13K07继续振摇1 h，离心后用2×YTAK培养基重悬后振摇过夜，次日离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，冰浴，离心，重悬沉淀即为噬菌体ScFv库，过滤后于4℃储存备用.2.4 抗体库的重组率测定、酶切鉴定和多样性分析取适量抗体库接种在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培养基中，37℃，振摇培养至A600=0.68，加入辅助噬菌体M13K07于37℃静置60 min;4℃，3 500×g离心15 min，沉淀重悬于20 mL2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培养过夜;在4℃条件下，8 000×g离心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g离心30 min弃上清，离心管倒置除去PEG液;沉淀用适量的PBS 重悬，移入另一离心管，反复吹打混匀，10 000×g离心5 min，上清即为噬菌体抗体库，检测库容.用SB培养液将所制备的噬菌体抗体库进行10倍系列稀释，分别加入100 μL大肠杆菌TG1(A600=1)，室温下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃过夜培养，次日计数噬菌落形成个数，计算噬菌体抗体库的库容，4℃保存.从SOBAG平板上随机挑取15个单菌落，进行PCR扩增用琼脂糖凝胶电泳检测ScFv的重组情况;提取PCR鉴定为阳性单菌落的质粒，用SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱;随机挑取阳性克隆，采用PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱.2.5 噬菌体抗体库的筛选用包被液稀释结核杆菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30g/L BSA的PBS封闭，PBS洗涤后，加入噬菌体抗体库100 μL，37℃温育2 h;吸去噬菌体抗体液，以PBST洗涤1次(第2轮洗涤5次，第3～5轮洗涤10次)，PBST洗涤1次，加入100 μL洗脱液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室温静置10 min;将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大肠杆菌E.coli TG1，37℃静置20 min，加入20 mL SB(含氨苄西林和四环素)，37℃培养2 h;加入M13K07、卡那霉素.进行5次反复淘洗，收集沉淀.特异性噬菌体抗体得到高度富集.2.6 ScFv的特异性鉴定将第5轮筛选后洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1，涂于SOBAG平板，过夜培养后，随机挑选细菌菌落接种于4 mL含Amp和四环素的SOBAG培养基中，37℃振荡培养过夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振荡培养2 h后加入40 μL M13K07，培养2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振荡培养12～16 h离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，4℃保存.将待检噬菌体抗体与等量10 g/L BSA混合，室温孵育20 min，加至经抗结核抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗涤2次后，以HRP标记的M13噬菌体单克隆抗体进行结合反应，TMB显色.3.1 抗体重链和轻链可变区基因的PCR扩增以提取出的RNA为模板逆转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区.产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别在300～400 bp间出现条带，结果见图1.3.2 单链抗体可变区片段(ScFv)的组装和全长扩增采用SOE-PCR的方法将抗体轻、重链可变区基因组装成ScFv片段，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的ScFv基因在700～800 bp间出现条带 (图2).3.3 抗体库的库容、重组率测定及酶切鉴定构建的初级抗体库经(库容=涂板后生长出的噬菌斑数数目/涂板菌液量/涂板菌液稀释的倍数)计算，初级库容量为3.5×106.随机挑取20个菌落，经PCR鉴定表明，重组率为80%，故次级库的库容量为2.6×106;阳性质粒做双酶切鉴定，电泳示在700～800 bp间出现条带(图3).3.4 抗体库的多样性随机挑取的10个单克隆，经PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示，抗体库中抗体分子的多样性良好，见图4.3.5 噬菌体抗体库的筛选将抗结核杆菌抗原噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选.可以看到随着洗涤次数的增加，噬菌体抗体的收获率增加，经过5轮筛选增加约110倍，表明噬菌体抗体库得到富集(见表1).3.6 噬菌体ScFv特异性的初步鉴定从第5轮筛选得到的菌落中随机挑选20个克隆，制备噬菌体抗体，经ELISA检测，阳性克隆孔中液体显色，阴性孔中液体不变色.显色后，阴性对照孔450 nm时A值为0.076，15株ELISA的A值较高，呈现阳性反应，其450 nm时A值分布于0.256～0.532之间，阳性克隆检出率约为75%.对其中12号阳性克隆的可变区DNA序列和氨基酸进行分析，结果该克隆重链可变区与GenBank中登录的免疫球蛋白IgG重链可变区VH3有92%同源性，κ可变区与V-J4有92%同源性.表明12号阳性克隆为抗结核杆菌抗原噬菌体抗体.噬菌体抗体库技术是采用PCR的方法将B细胞全套可变区基因克隆出来，与噬菌体包膜蛋白融合表达，从而展示于噬菌体表面，即可建成噬菌体抗体库.ScFv的基本结构为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗体分子量只有全抗体的1/6，抗体只有可变区片段，不含恒定区，免疫原性较低，故易于穿过血管壁和组织屏障，没有Fc段，所以减少了与组织的非特异性结合，同时保留了与抗原结合的特异性和亲和性，具有结构简单，易于大规模生产，成本低等优点，因此在临床、科研、工业和新药设计等领域均具有诱人的应用前景［4-6］.ScFv抗体在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用［7-13］.目前，在多种噬菌体抗体库的构建，并从其中筛选出多株具功能活性的小分子抗体，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等单链抗体或Fab抗体［14-17］，有些已进入了临床I/II期试验.人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题，极大地推动了人源抗体的研究及应用［18-20］.抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因由相对保守的骨架区和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区(CDR)组成，虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性，但其骨架区的序列和前导序列相对保守，所以抗体可变区PCR引物的设计应可能考虑亲本抗体可变区序列的完整性和真实性.库容量大小影响抗体库质量的最主要因素，而基因的多样性是决定库容量大小，其直接决定了接下来筛选高亲和力的单链抗体［21］.因为淋巴细胞含目的抗体基因的mRNA是高丰度，有利于所建文库被筛选及克隆出高亲和力的抗体，所以选用淋巴细胞建库较好［3］.本研究扩增设计可变区引物时引用路艳等的工作［3］，通过提取患者康复后的外周淋巴细胞总RNA，经RT-PCR分别扩增出H链和L链可变区基因，将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体，并转化至感受态TG1菌，经辅助噬菌体M13K07拯救，获得人源抗结核杆菌噬菌体展示单链抗体库，本研究为结核病的预防、诊断、治疗等研究奠定了基础.此研究为结核临床防治研究奠定了基础.【相关文献】［1］吴虢东，王玲.抗结核中药的研究进展［J］.医学综述，2007，13(6):475-476.［2］李菁，林彤，宋帅，等.基因工程重组抗体技术的研究进展［J］.生物技术通报，2009(10):40-44.［3］路艳，韩跃武，韩亚萍，等.抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(11):1063-1067.［4］HUSTON 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saquinavir，zidovudine，and zalcitabine［J］.New Engl J Med，1996，334(16):1011-1077.［10］FINNERN R，BYE J M，DOLMAN K M，et al.Molecular characteristics of anti-self antibody fragments against neutrophil cytoplasmic antigens from human V gene phage display libraries［J］.Clin Exp Immunol，1995，102(3):566-574.［11］HUDSON P J.Recombinant antibody constructs in cancer therapy［J］.Curr Opin Immunol，1999，11(5):548-557.［12］WU A M，WILLIAMS L E，ZIERAN L，et al.Targeted gene delivery to mammalian cells by filamentous bacteriophage［J］.Tumor Targeting，1999，49(1):47-54.［13］FITZGERALD K，HOLLIGER P，WINTER G.Improved tumour targeting by disulphide stabilized diabodies expressed in pichia pastoris［J］.J Mol Biol，1999，288:203-211. ［14］ZEBEDEE S L，BARBAS C F，HOM Y L，et al.Human combinatorial antibody libraries to hepatitis B surface antigen［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:3175-3179. ［15］CAI X，GAREN A.Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells:selection 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耐多药结核分枝杆菌二线药物耐药测试情况论文

耐多药结核分枝杆菌二线药物耐药测试情况分析【摘要】目的了解耐多药肺结核病二线药物耐药情况，为制定耐多药肺结核控制方案提供参考。

方法筛选2004——2007年本实验室初鉴定为结核分枝杆菌的327株耐多药的临床分离菌株，采用绝对浓度法进行oflx、ak、pas、pto药敏试验。

结果xdr-tb有11例，占mdr-tb的3.36%，初治耐二线药物的有50例，占28.74%；复治耐二线药物的有49例，占32.02%。

结论开展二线抗结核药物敏感性试验，对发现超耐药结核病和制定耐多药结核病的治疗方案有重要指导意义。

【关键词】结核，肺/耐药；结核，二线药耐药性分析文章编号：1004-7484（2013）-01-0314-02结核病是全球重大的公共卫生问题，是一种严重危害着人类健康的慢性传染病。

21世纪初出现的耐多药结核病（mdr-tb），由于治疗费用高、治疗失败率高使结核病防治更加困难，致使耐药结核病成为全球结核病控制的一大难题。

who估计全世界每年约有50多万例mdr-tb，而mdr-tb治疗失败，极易导致超耐药结核病（xdr-tb）[1]。

而我国现有的dots策略并没有将mdr-tb的防治纳入其中，对这部分患者的治疗和管理亟待探讨解决。

本文将分析327例mdr-tb的二线药物耐药性测试结果，希望为mdr-tb患者的规范化治疗和管理提供参考。

1材料和方法1.1材料1.1.1菌株来源2004——2007年经黑龙江省结核病防治所初鉴定为结核分枝杆菌的327例mdr-tb临床分离菌株，其中初治菌株174例，复治菌株153例。

1.1.2药物来源药物敏感性试验所用的4种二线抗结核药物纯品，氧氟沙星（oflx）、对氨基水杨酸钠（pas）、丙硫异烟胺（pto）、阿米卡星（ak）均使用国产纯粉。

1.2方法采用绝对浓度间接法分别进行oflx、ak、pas、pto药敏试验，菌种初筛用噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸鉴别培养基。

方法参照《结核病诊断实验室检验规程》[2]。

分枝杆菌噬菌体在结核病诊断、耐药筛选中的应用研究

措施，估计２０００年一００年间，２２全球范围内将有ｌＯ亿人新感染结核分枝杆菌（ｙｏａｔｉｂｒｌＭｃｃｒｍｔｅｕ．ｂｅｕｕｃｏ
）３５亿人死于结核病。结核病的全球传播由于，．
耐药结核分枝杆菌株特别是耐多药结核分枝杆菌
（至少同时耐异烟肼和利福平）的广泛存在而变得更加复杂 … 。我国２００５年发病人数为１５３０死２９８，亡人数为６１，７３发病人数和死亡人数居于各种传染病之首，病率和死亡率较２０发０４年分别增加了２．３和３５０％。２０我国第四次结核病９０％６．４００年流行病学调查资料显示，结核病耐药问题突出，总耐药率２．％，多药结核病（ｕｔｍｇｒｓｔｃ．７８耐Ｍｌｄｉａｅｔｉｅｓｎｕｂｒｕｏｉ，ＲＴ）生率１．％Ｃ。我国结核病ｅｌｓＭＤ —Ｓ发ｅｓ０７３｝防治工作的形势非常严峻。结核分枝杆菌的诊断和
尽管结核病（ｕｅｕｓ，Ｓ是一种可控制和ＴｂｒｌｉＴ）ｃｏｓ可治愈的疾病，但它是在１９９３年被ＷＨＯ宣布为全球紧急状态的唯一传染病。如果不强化结核病控制
１噬菌体生物扩增法在结核病诊断和耐药测试中
的应用
Ｄｖｄ等研究了氯苯吩嗪、菌素、福平、ａｉ黏利链霉素、氨苯砜、异烟肼和乙胺丁醇能抑制噬菌体Ｄ９２的增殖，在结核分枝杆菌菌体内的噬菌体则不受影响。１９９７年Ｗｉｏｌｎ等开发了ＰａｓｈＢ法，立了一建个快速检测结核分枝杆菌和药物敏感度的技术平台ｃ。Ｐａ５ｈＢ法的基本原理是，的结核分枝杆菌可３活以保护菌体内的噬菌体免受噬菌体杀灭剂的影响。

以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物

以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】进入21世纪，结核病仍然是临床上发病率和死亡率最高的传染病之一。

目前，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的多重耐药，以及在抗结核药物作用过程中结核分枝杆菌的持留状态，已成为全世界结核病控制工作的主要障碍。

异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，决定了结核分枝杆菌的持留性。

在文中我们将描述异柠檬酸裂解酶的基本性质及结构特征，希望能通过对ICL抑制剂作用区域的了解来推动抗持留结核分枝杆菌药物的研究。

【关键词】异柠檬酸裂解酶；结核分枝杆菌；持留状态ABSTRACT Getting into the 21st century, tuberculosis remains a leading cause of mortality worldwide. The main obstacles to the global control of the disease are emerging multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis and the recalcitrance of persistent infections to treatment with conventional anti-TB drugs. Isocitrate lyase (ICL) is a keyrate-limiting enzyme in the glyoxylate bypass, and it is needed for persistent Mycobacterium tuberculosis to get energy. Consequently, isocitrate lyase is an attractive targets for the development of new antituberculosis agents. In this paper, the characteristion and structure of ICL were decribed. Our understanding of the inhibitor-bound sites will provide a springboard to find drugs which target the tuberculosis infection.KEY WORDS Isocitrate lyase; Mycobacterium tuberculosis; Persistent infections结核分枝杆菌的持留状态是治疗结核病的瓶颈之一。

结核分枝杆菌耐药性的研究

结核分枝杆菌耐药性的研究结核病是一种由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 引起的慢性传染病。

该病在全球范围内广泛存在，尤其在发展中国家中尤为常见。

然而，随着时间的推移，病原体逐渐进化并发生耐药性。

毒菌学家们最近对结核分枝杆菌的耐药性进行了研究，以了解这种病原体的新的抗药性机制。

结核分枝杆菌的耐药性结核分枝杆菌是一种革兰阳性的细菌，存在于气溶胶中，并通过呼吸道被人体吸入。

这种细菌可以耐受抗结核药物，使得病人复发或出现难治的病例。

结核分枝杆菌的耐药性主要分为以下几种类型：1.单药耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物产生耐药性。

2.多药耐药：结核分枝杆菌对异烟肼和利福平两种药物产生耐药性。

3.极耐药性：结核分枝杆菌对异烟肼、利福平和其中至少一种次级药物产生耐药性。

该病原体的耐药行为是由许多基因突变引起的。

耐药突变可以降低药物与细菌的相互作用，导致药渗透减少或抗菌药物代谢增加等现象。

因此，治疗复杂、费用高昂，对全球公共卫生构成威胁。

结核分枝杆菌的基因组学研究随着基因组学技术的迅速发展，科学家们能够更好地理解结核分枝杆菌获得耐药性的基因机制。

研究现有的截至2010年的稳定基因组序列后，毒菌学家们发现结核分枝杆菌的比较基因组学和基因功能分析有助于了解该菌的新的耐药性机制。

一个主要的发现是，在结核分枝杆菌的基因组中，有一个名为WhiB7的调节因子，它可以在细胞内激活多个下游基因，从而促进细菌对异烟肼的耐药性。

此外，已经证明，哺乳动物宿主中具有抗击结核分枝杆菌的免疫路径（包括干扰素致死和内体消化等）。

结核分枝杆菌的药物治疗研究药物治疗是治疗结核病的主要方法。

第一线药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等。

但是，由于其慢生长率，结核分枝杆菌需要治疗长达6到9个月，而治疗代价昂贵，并且表现出不可预测的耐药性问题。

一些研究表明，与传统药物相比，新开发的抗结核药物更具潜力。

这些药物包括间位卡那霉素（一种耳鼻喉科常用药物）、利福霉素和赛拉奥星等。

结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究

结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究林媛;朱宁屿;蒋建东;司书毅【摘要】目的筛选结核分枝杆菌 FtsZ 的特异性抑制剂，为抗结核药物的研发提供先导化合物。

n 方法应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌 FtsZ 抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选，获得能够抑制 FtsZ 的化合物202E，对其进行IC50以及分子水平活性测定，并利用 DS 4.0软件将化合物202E 与 FtsZ 的活性位点进行对接。

n 结果化合物202E 能够抑制结核分枝杆菌 FtsZ 的 GTP 酶活性，其 IC50为15.46μmol/L。

202E 还能够抑制 FtsZ蛋白的聚合。

通过分子对接，发现202E 能够与 FtsZ 的GTP 结合位点结合，抑制 FtsZ 的 GTP 酶活性。

n 结论化合物202E 是活性较好的结核分枝杆菌 FtsZ 抑制剂。

%Objective The aim of the study is to find new anti-tuberculosis agents which can inhibit the activity of FtsZ in Mycobacterium tuberculosis n Methods By using the high-throughput screening model for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ, compound 202E was selected. We assessed the IC50 value and molecular level activity of 202E. And then we docked compound 202E with active site of FtsZ. n Results Compound 202E was found to inhibit GTPase activity of Mycobacterium tuberculosis FtsZ with IC50 of 15.46 μmol/L. 202E also reduce the polymers of FtsZ. Molecular docking showed that 202E bound to the GTP site of FtsZ and inhibited the GTPase activity of FtsZ. n Conclusion Compound 202E is a promising lead for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】4页(P109-112)【关键词】结核分枝杆菌;酶抑制剂;FtsZ【作者】林媛;朱宁屿;蒋建东;司书毅【作者单位】100050 北京，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室;中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室;100050 北京，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室;中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室【正文语种】中文方法应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选，获得能够抑制 FtsZ的化合物 202E，对其进行 IC50以及分子水平活性测定，并利用 DS 4.0软件将化合物 202E与 FtsZ的活性位点进行对接。

抗结核分枝杆菌持留菌的药物研究进展

抗结核分枝杆菌持留菌的药物研究进展
陆宇
【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》
【年(卷),期】2007(028)002
【摘要】持留态结核分枝杆菌具有对现有抗结核药物表型耐药的特征,是结核病病程迁延和复发的主要原因.因此,研发抗结核分枝杆菌持留菌的药物,对缩短抗结核治疗疗程,减少耐药性发生意义重大.本文就结核分枝杆菌持留菌的耐药机制、PA-824等新药的研究进展以及筛选评价模型进行简要综述,为抗结核分枝杆菌持留菌药物的研究提供参考.
【总页数】5页(P56-60)
【作者】陆宇
【作者单位】北京市结核病胸部肿瘤研究所,北京,101149
【正文语种】中文
【中图分类】R9
【相关文献】
1.抗持留性结核分枝杆菌的药物研究 [J], 陆宇
2.抗结核分枝杆菌持留菌的药物研究进展 [J], 陆宇
3.以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物 [J], 王旸;肖春玲
4.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与持留相关性的研究进展 [J], 常蕴青;李传友;唐神结;刘毅
5.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与持留相关性的研究进展 [J], 常蕴青; 李传友; 唐神结; 刘毅
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姓名：张俊学号：S1170850新型抗结核分枝杆菌药物筛选模型摘要：结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，世界卫生组织报告显示，全球有20亿人感染结核分枝杆菌，其中会有十分之一的人会发展成结核病。

结核病已成为仅次于艾滋病的第二大传染性疾病。

近年来结核病发病呈逐年攀登趋势，目前多重耐药结核分枝杆菌的出现以及结核分枝杆菌在患者体内的持留状态已经成为结核病预防和治疗过程中的重大障碍，因此寻找新的药物作用靶点，建立新的药物筛选模型成为开发新型抗结核药物的关键。

此综述介绍了新型的抗结核药物筛选模型，并说明模型的建立方法。

关键词：结核病，抗结核药物，耐多药结核病，筛选模型Abstract: Tuberculosis is a infectious disease caused by Mycobacterium, as the World Health Organization report , 20 million people worldwide infected with Mycobacterium tuberculosis , there will be one tenth of the people will develop TB. Second only to AIDS, tuberculosis has become the second largest infectious diseases. In recent years, the trend of TB incidence was gradually increasing; the emergence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis has become the major obstacles of the tuberculosis prevention and treatment. Searching the new drug targets, establishing a new drug screening model becomes the key to the development of new anti-TB drugs. This review describes the new anti-TB drug screening model and explains the model approach.Keywords: tuberculosis, anti-TB drugs, MDR-TB, screening model结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。

结核菌可能侵入人体全身各种器官，主要侵犯肺脏，因此称为肺结核病。

结核病又称为痨病和白色瘟疫，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。

人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。

传染源是接触排菌的肺结核患者。

结核病可以分为原发性肺结核、血行播散型肺结核、继发性肺结核和结核性胸膜炎。

解放后人们的生活水平不断提高，结核已基本控制，随着环境污染和艾滋病的传播，以及耐药结核分枝杆菌的出现，结核病又卷土重来，发病率愈演愈烈。

全球有20亿人感染结核分枝杆菌，其中会有十分之一的人会发展成结核病其中三分之一是处于潜伏感染状态[1−2]。

一、抗结核药物1、抗结核药物的历史上世纪40年代，链霉素（SM）和对氨基水杨酸钠（PAS）先后发现，而SM+PAS 疗效优于单一用药，并可以预防结核分枝杆菌产生耐药性[3]。

异烟肼（INH）发现后，INH+PAS联用的优势得到证实[4]。

1952年“三联疗法”（SM+INH+PAS）产生，疗程为18到24个月，并可视情况将PAS替换为乙胺丁醇（EMB）或氨硫脲（TB）[5−6]。

1965年利福平（RFP）用于临床，并证实INH和RFP能够缩短疗程至九个月；后来，吡嗪酰胺（PZA）与上述药物联用可缩短疗程至6个月[7]。

但是至今近40年来却没有发现一个全新结构的TB药物。

2、抗结核药物的现状目前，临床应用的TB药物分为一线和二线药物[8]，前者有RFP、INH、EMB、PZA等；后者有阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、丙硫异烟胺、环丝氨酸、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等。

3、新型抗结核药物研发的必要性和紧迫性（1）40余年来没有一个新的高校抗结核药物问世；（2）艾滋病流行、结核病疫情回升、耐多药结核病例增多;（3）可根除结核病的新型疫苗目前处于研究阶段；（4）现有的抗结核药物不能解决结核持留性的问题，而持留菌是结核病复燃和复发的常见原因。

4、新型抗结核药物的目标[9]（1）缩短疗程至1到2月，或将DOTS中的药物数量和剂量明显减少；（2）对耐多药结核病有效，且无交叉耐药；（3）对结核潜伏感染提供更有效的治疗效果。

二、耐多药结核病1、耐多药结核病耐多药结核病是指患者感染的结核杆菌在体外证实对异烟肼和利福平耐药，而极度耐药结核菌指患者在耐多药的基础上，还对6种主要抗结核药物中的三种以上的二线抗结核药耐药。

2、耐药结核产生的原因耐药结核病根据其产生原因的不同可以分为两种：原发性耐药和获得性耐药。

原发性耐药是指没有接受过抗结核药物治疗而发生结核分枝杆菌耐药，有既往抗结核治疗史的耐药结核患者称为获得性耐药。

三、药靶发现新方法1、基因组学与药靶发现[10]：迄今为止，结核杆菌复合群中已有3个的全序列被测定，他们分别含有4．4×10 (+／-0．1)碱基对，约4000个编码蛋白质的基因和50个编码稳定的RNA基因。

对于H37Rv来说，用生物信息学分析法，已准确预测出40%的基因的功能，另有20%的基因已经知道它们的部分功能，而剩下的40%的基因的功能完全未知，根据它们的生物学功能或者与已知药靶的相似功能就可以发现潜在的药物靶位。

那些为分枝杆菌特有的基因，可以成为专门针对分枝杆菌的新型药靶。

相反，大量的和其他种属功能相似的基因，即保留性基因，可作为光谱抗生素的候选。

由于人类基因组的序列已可获得，可以排除与人体同源的基因和蛋白质，防止药物同时作用于细菌和人体，从而减少副作用的发生。

药物候选也可以增加特异性，去除大多数光谱抗生素不加选择地破坏肠道菌丛的副作用。

2、比较基因组学与药靶发现：麻风分枝杆菌与结核分枝杆菌都具有包内寄生、生长缓慢的特征，且麻风分枝杆菌基因组约3.72Mb，比结核分枝杆菌小得多，它共有1605个蛋白质编码基因，约占基因组的49.5%，显示麻风分枝杆菌正在进行缩减性消亡。

麻风分枝杆菌约有27%为假基因，即有1114个是不活动的阅读框架，但在结核分枝杆菌的对应部分仍有功能。

剩余的23.5%的基因组为非编码基因，可能是没有功能的。

通过对结核和麻风的基因和蛋白进行比较，发现它们共同具有1433个蛋白质，除去和其他原核生物、真核生物相同的蛋白质后，只剩下219个蛋白质。

由于分枝杆菌在人体内需要相同的微环境、遭遇相同的生理学压力和免疫反应，这些基因产物具有特殊的功能，在分枝杆菌的胞内生长具有重要作用。

这些蛋白质可以成为新型药物靶位的候选。

通过和麻风分枝杆菌基因组比较，结核分枝杆菌只有Rv0462和麻风分枝杆菌对立，其余4个在麻风分枝杆菌中均为假基因，因此研究工作可集中在Rv0462就可以了，这就为研究者节省了大量时间[11]。

3、结核杆菌体内作用机制和药靶发现：早在1950年，Segal[12]就做了结核菌在体内外生长的对比研究。

这些研究提供了令人信服的生化证据，即结核菌的自然感染状态与在人工培养基上的生长是不相同的。

Segal观察到细菌在体内外使用的碳源是截然不同，在体外生长时倾向于使用糖类作为碳源，在体内生长时倾向于使用脂肪酸作为碳源。

这一现象的遗传学基础已被分子生物学证实，即异柠檬酸裂合酶（ICL），它是脂肪酸代谢中的关建酶。

可以将ICL的抑制物作为潜在的治疗药物，但在传统的方法中筛选抗结核药物时，以ICL为靶位的药物被错过了，因为ICL在体外标准培养基中生长时并不是必须的。

四、抗结核药物筛选模型1、ICL抑制剂酶水平筛选模型1.1、原理致病性菌株结核分枝杆菌H37Rv全基因组测序工作的完成，为研究新型抗结核药物提供了大量的药物靶点[13]。

ICL作为乙醛酸途径的关建酶，当培养基的碳源受到限制或者缺氧时，菌体内糖酵解途径减弱，乙醛酸循环加强，酶活性上调。

ICL对结核分枝杆菌在巨噬细胞内的持续存活至关重要。

乙醛酸途径存在于原核生物、低等真核生物和植物中，在哺乳动物体内不存在[14]，故可将ICL作为特异性较强的药物靶点，建立新型抗结核分枝杆菌药物的筛选模型[15]。

1.2、方法(1)结核分枝杆菌H37RvICL基因的克隆(2)重组ICL的表达与纯化(3)重组ICL活性检测及动力学参数测定(4)ICL抑制剂酶水平筛选模型的建立(5)乙醛酸途径抑制剂细胞水平筛选模型的建立1.3、结果与讨论以异柠檬酸裂解酶作为靶点筛选得到的抗结核药物不仅可以有效杀灭处于持留状态的结核分枝杆菌，缩短结核病治疗疗程，同时由于哺乳动物体内不存在乙醛酸循环，因此以ICL为靶点开发的新药毒副作用较小。

方法中针对ICL为靶点，先在酶分子水平后在菌体细胞水平建立筛选模型，不仅是对样品活性的验证，还使筛选模型更接近于持留状态的结核分枝杆菌，筛选结果更具有真实性、可靠性。

2、以蛋白激酶G为靶点的筛选模型2.1、原理结核分枝杆菌在被巨噬细胞吞噬，形成噬体后，可以通过阻碍吞噬体的成熟及其与溶酶体的融合，而使其自身不被溶酶体酶降解，从而在巨噬细胞内长期存留下来[16]。

此时的细菌代谢活动降至最低，生长繁殖几乎停止，不易被抗菌药物杀灭，这种类似于休眠的长期存活状态被称为“持留”状态。

当机体免疫力下降时，持留状态的细菌又可以继续生长繁殖，恢复致病力。

持留状态形成的原因很复杂，涉及多方面机制。

其中，结核分枝杆菌分泌的蛋白激酶G-一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶对于持留状态的形成和维护有重要作用[17-19]。

因此可以通过建立酶水平的筛选模型来筛选有效的蛋白激酶G抑制剂，为今后开发真正有效抑制持留菌的抗结核新药奠定基础。

2.2、方法2.2.1结核分枝杆菌蛋白激酶G基因原核重组质粒的构建及其表达(1)蛋白激酶G基因的体外扩增(2)Pet30b-蛋白激酶G表达载体的构建(3)蛋白激酶G基因在大肠杆菌中的表达及蛋白激酶G蛋白的纯化2.2.2重组蛋白激酶G酶活性的测定2.2.3重组蛋白激酶G的酶学性质测定(1)最适反应温度的测定(2)最适pH的测定(3)反应速度与酶浓度的关系测定(4)最适反应时间的测定(5)反应动力参数的测定2.2.4筛选模型的建立与应用(1)计算筛选模型的信噪比，并对模型进行可行性分析(2)对待测样品进行前处理(3)测定待测样品对蛋白激酶G的抑制作用(4)计算抑制率(5)排除假阳性结果(6)利用MIT法检测阳性药物对细胞存活的影响2.3结果与讨论结核分枝杆菌的蛋白激酶G具有自我磷酸化的功能，它可以催化ATP上的磷酸基团添加到蛋白激酶G自身的丝氨酸/苏氨酸残基上使之磷酸化，并生成ADP[20]。