腺病毒包装操作手册

汉恒重组腺病毒操作手册

目录

腺病毒安全使用和注意事项

腺病毒储存与稀释的注意事项

一、整体实验流程

二、实验材料

三、腺病毒包装和浓缩

四、重组腺病毒滴度(PFU的测定

五、重组腺病毒感染目的细胞

六、重组腺病毒用于动物实验

附1:汉恒生物腺病毒载体

附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较

腺病毒安全使用和注意事项

➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要!!!*

1腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别内操作。

2操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3操作病毒时需要特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用

70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

4接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。

5如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。

6病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。

7实验完毕后请用香皂清洗双手。

➢腺病毒储存与稀释的注意事项

1腺病毒的储存

收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳;如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。

注:

a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%,因此在病毒使用过程中

尽量避免反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装(200 μl/tube,收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。

b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴

度测定方法。

2腺病毒的稀释

需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点:感染范围广,几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织;感染效率高达100%,可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染;对外源基因容载能力大(可以高达8Kb;不整合基因组;滴度高,操作方便。因此,重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型(Ad5,其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维(fiber和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞,然后从内吞体(endosome转移到细胞质和细胞核内,借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。

目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种,其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体,然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3,其中E3基因对病毒产生并非必需。因此,腺病毒包装

必需依赖表达E1的细胞系,例如HEK-293,HEK-293A等。

相对于Adeasy系统,AdMAX系统操作便利,并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统,该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(deltaE1, 3Cre双载体组成。

一、整体实验流程

二、实验材料

该病毒包装系统为两质粒系统,组成为穿梭质粒(pHBAd系列,包括包括过表达、干扰等类型和骨架质粒(pBHGlox(deltaE1, 3Cre。

1、载体信息(见附1

2、菌株:大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

3、细胞株:293A,腺病毒的包装细胞,表达腺病毒基因E1,为贴壁依赖型成上皮样细胞,经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗(DMEM完全培养基。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70% 以下,则293A细胞能连续培养3~4个月维持原有的细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代,则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增加,293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现,我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种,以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,可增加细胞复苏成活率。

注:为了达到最好的细胞状态,提高腺病毒出毒效率,推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveIt TM抗支原体试剂。

三、腺病毒包装和浓缩

(一质粒构建和扩增

构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提,浓度要求大于1 μg/μl,A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提(质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度。

注:质粒构建推荐使用汉恒生物HB-infusion TM无缝克隆试剂盒。

(二腺病毒包装

事先准备好用于包装病毒的293A细胞(50-70%的汇合度和病毒质粒,转染每个直径为6 cm的培养皿成分如下:

pHBAd系列穿梭质粒2 μg

pBHGlox(deltaE1, 3Cre 4 μg

DMEM需在37℃水浴中预热,LipoFiter TM转染试剂需恢复至室温方可使用,并在使用前摇匀。转染6h后置换成新鲜培养液。

注:1、LipoFiter TM转染试剂为汉恒生物产品,使用说明参考LipoFiter TM说明书。

2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。

(三病毒收集

病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成,通常在培养液中加入低熔点琼脂糖,转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。如果穿梭质粒带有荧光蛋白(GFP或RFP,则在空斑形成之前观察荧光,以确定转染效率。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起,放入1 ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等,然后比较滴度,使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。

空斑示意图