腺病毒包装注意事项
腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP 和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒如果用脂质体，哪家的最好H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
3.重组腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用AdEasy系统可以吗具体的实验步骤是来自什么地方主要细胞及试剂的来源.BIOgene公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我AdEasy的基本原理请参阅文献19984.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定就用肿瘤细胞来测行吗只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用HEK293细胞，用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。
注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。
? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。
腺病毒的包装与制备
腺病毒的包装与制备1 转染AD293第一轮:1. pAd质粒转染AD293，可使用六孔板或60mm皿。
当细胞出现明显细胞病变效应(CPE)时回收细胞，(吸去培养基用PBS洗一遍，若细胞已经悬浮则取所有培养基低速离心，细胞用PBS洗一遍)，并用0.5ml PBS重悬。
置于1.5ml microcentrifuge tube中2. 裂解细胞:进行四轮-80?/37?3. 12000g 10min 室温离心，将上清移入新的离心管中。
-80?保存。
第二轮:1. 取第一轮的病毒液50μl(或设置梯度)感染100mm皿。
(如细胞第一天就出现病变则用量太高，一般应在第一天少量病变，第二三天全部病变)。
重复第一轮方法裂解细胞并收集腺病毒，终体积1ml第三轮取第二轮的病毒感染4个150mm皿(100μl/皿或设置梯度)，并用CsCl密度梯度法纯化腺病毒。
2 透析Transfecting AD-293 Cells以Lipofectamine? 2000说明书为本，更改了细胞密度和DNA量51. One day before transfection, plate 4x 10 cells per 6-wellofgrowth medium without antibiotics so that cells will be 50-70% confluent at the time of transfection. 2. For each transfection sample, prepare complexes as follows:a. Dilute 4μg linearized DNA in 250 μl of Opti-MEM I Reduced Serum Medium without serum (or other medium without serum). Mix gently.b. Mix Lipofectamine? 2000 gently before use, then dilute 10μl lipofectaminein250 μl of Opti-MEM I Medium. Incubate for 5 minutes at room temperature. Note:Proceed to Step c within 25 minutes.c. After the 5 minute incubation, combine the diluted DNA withdilutedLipofectamine? 2000 (total volume = 100 μl). Mix gently andincubate for 20 minutes at room temperature (solution may appear cloudy). Note:Complexes are stable for 6 hours at room temperature. 3. Add the 500 μl of complexes to each well containing cells and medium. Mix gently by rocking the plate back and forth.4. Incubate cells at 37?C in a CO2 incubator for 17-10days prior to testing for GFP. Medium may be changed after 4-6 hours.Preparing the Primary Viral Stocks1. Prepare a small dry ice-methanol bath and a small 37?C water bath and placethem in the laminar flow hood.2. Carefully remove growth medium from adenovirus-producing AD-293 plates andwash the cells once with PBS. Take care not to lose any clusters of floating andpartially attached cells during this process.Note :If the cells are already mostly detached, pipet up and down gently in the growth medium until cells become completely resuspended. Transfer cell suspension to a screw cap centrifuge tube and pellet the cells by low speed centrifugation. Aspirate medium, and wash the cells once with 0.5 ml of sterile PBS. Resuspend the cell pellet in a fresh 0.5 ml sterile PBS (per 60-mM dish) and proceed to Step 5. 3. Add 0.5 ml of PBS to each plate of cells to be harvested. Collect the cells by holding the plate at an angle and scraping the cells into the pool of PBS with a cell lifter.4. Transfer the cell suspension to a 1.7-ml screw-capmicrocentrifuge tube. If duplicate DNA samples were transfected, the cells from duplicate samples may be combined in the microcentrifuge tube at this stage.5. Subject the cell suspension to four rounds of freeze/thaw by alternating the tubes between the dry ice-methanol bath and the 37?C water bath,vortexing briefly after each thaw.Note :Each freeze and each thaw will require approximately 5 minutes’ incubationtime.6. Collect cellular debris by microcentrifugation at 12,000 × g for 10 minutes at room temperature.7. Transfer the supernatant (primary virus stock) to a fresh screw-cap microcentrifuge tube. Viral stocks can be stored for more than one year at –80?C.腺病毒扩增1. Plate 5 X 106 QBI-293A cells in a 100 mm culture dish in 10 mL DMEM 5%.2. Remove 50μl(100μl) of the viral stock of the first amplification, complete to 1 mL with DMEM 5% and mix. This dilution will give a MOI of about 5.3. Remove the medium from the 100 mm dish, delicately add the viral particle mix onto the cells taking care not to disturb the monolayer and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2.4. Add 9 mL of DMEM 5%.5. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 72 hours. At this point you should have between 5 x91010 and 5 x 10 VP in 10 mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired.If this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume or about 1mL. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8. 6. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C until completely frozen/37?C until fully thawed. 7. Pellet cell debris in a sterile 15 mL conical tube. Centrifuge at maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes, remove and store the supernatant in another sterile 15 mL conical tube at -20?C or -80?C.8. Plate 3 x 107 QBI-293A cells in 3 x 175 cm2(150mm dish) culture flasks (1 X 107cells/flask).9. Mix 3 mL of cell lysate supernatant from step 7 with 12 mL DMEM 5%. Remove the mediumfrom the flask, then delicately add 5 mL of supernatant mix perflask on the cells, taking care notto disturb the monolayer, and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.10. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.11. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 48 to 72 hours. At this point you should have between 3 x 1010 and 3 x 1011 VP in 90mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. Again, if this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8.12. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C.13. Pellet cell debris in a sterile 50 mL conical tube. Centrifugeat maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes. Remove and store the supernatant.14. Plate 3 x 108 QBI-293A cells in 30 x 175 cm2 culture flasks (1 X 107 cells/flask). 15. Mix 45 mL of cell lysate supernatant from step 13 with 105 mL DMEM 5%. Remove the medium from the 175 cm2 flasks, pour 5 mL of the cell lysate mix per flask on the cells, taking care not to disturb the cell monolayer, and spread by slowly rocking the flask 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.16. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.17. Put the cells back at 37?C in a CO2 incubator for 2-3 days. You should now have between 3 x 111210 to 3 x 10 VP. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. If you want to produce viral particles, first collect and pellet the infected cells, then resuspend in 5 mL DMEM 5%. Extract viral particles by performing three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C; pellet cell debris by centrifugation. At this point you should have between 3 x 1011 to 3 x 1012 recombinant virus particles in 5 mL DMEM 5%, for a final VP/mL of 6 X 1010 to 6 x 1011. Your viral particle pre-stock will now be ready to be titrated directly, asdescribed in section 5.8, or purified, using standard cesiumchloride gradients (section 5.7). Further amplifying your recombinant virus on 109 cells will result in the production of a viral stock, while amplification on 1 x 1010 cells is technically a viral production. You should never use the virus from a production stock to infect additional cells because you will at the same time significantly increase the amount of RCA generated. Instead, use virus from an earlieramplification steps such as the stock, pre-stock or pre-amplification in order to produce more virus particles. You can eventually go back to the purified eluted plaque in order to minimize RCAproduction as much as possible. If a purified eluted plaque is no longer available, you will have to perform a plaque assay of your recombinant virus and start the amplification step again from a purified eluted plaque, after analysis of your clone. If more material than produced in the first 4 passages(see Table 5) is needed, remember to always return to the previous passage as your source for virus. For example, use virus from passage 2 in order to generate passage 3. Note that once you have depleted all of your viruses from passage 2, you must use virus from the first amplification in order to create a new passage 2. Proceeding in this fashion will keep the level of RCA as low as possible. If you want to overexpress a protein, pellet the cells and extract the protein according to its characteristics. Typically, about 1-5 mg of a well-expressed protein can beretrieved from the pellet. It is recommended to first determine the best time pi to extract the protein on a smallscale, then to proceed with large-scale protein production.CsCl密度梯度法纯化腺病毒1 Add either purified Ad or unpurified Ad (medium) to monolayer culture cells (50-100pfu/cell)2 If using one T150 flask total 10-12 ml medium is used to cover the cells and allow cells to culture for one day3 Cells should look swollen and part of the cells may be floating. Another 10ml of complete medium is added into cells and allow another day culture (36-40hrs infection period )4 All of the cells should be floating. Collect all the cells and resuspend them in 0.5-1ml of complete medium . Also save the culture medium and store at -70?.5 Freeze in methanol/dry ice bath and thaw at 37?. Repeat for 3-4times6 Spin at high speed for 5min.7 Make 40% and 15% CsCl in TBS, PH8.1(50ml each and keep at 4?)8 Make CsCl gradient solution(5ml of 15% and 4.5ml of 40%) in Beckman centrifuge tube (14*89mm, which frist sw41 rotor)9 Load the supernatant from step 6 on the top of gradient10 Centrifuge at 4? 30000rpm for 16hr11 Two bands can be seen: the faint top band (mainly defective Ad) and the lower Ad band. Only the lower band is collected.12 the Ad is dialyzed in TBS PH8.1 for 1hr and then in TBS containing 10% glycol twice (1hr each time)13 Determine the Ad concentration, aliquot into microfuge tube(50μl each )and store at -70?TBS: tris 10mM, NaCl 0.9%, PH8.115% CsCl(50ml): 9.085g CsCl+47.69ml TBS40% CsCl(50ml): 28.45g CsCl+42.7ml TBSDialyze:1 透析袋: MW 8000-144002 透析缓冲液: TBS PH8.1 灭菌甘油步骤:1冲洗透析袋，如果是蛋白则需NaHCO-NaEDTA煮沸处理后用蒸馏水洗。
腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染
腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞详情见AD-293 Cells.pdf，AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P31-P32）2.细胞转染方法一、详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P28-P29）C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf3.病毒收集详情见AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P34）二、扩增详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P29-P30）三、纯化(i) 病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M.(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylenewide-mouthed bottles.(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, perbottle. Resuspend the pellets byvigorously pipetting liquid up and down.(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
腺病毒包装注意事项
腺病毒包装注意事项
腺病毒(adenovirus，Ad)是一种球形、无包膜、直径约70～80 nm颗粒病毒，腺病毒基因组为大小为36kb的双链线性DNA，两端各有长约100 bp的反向重复序列，编码30多种“调控蛋白”。
腺病毒包装注意事项：
L，克隆筛选时阳性克隆板子卡那霉素浓度可适当调整；
2. 目的基因序列中有PacI酶切位点时需要进行无义突变；
3.鉴定正确的重组子一定要转化DH5a感受态细胞，因为重组子在BJ5183中是不稳定的。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
高效包装腺相关病毒的原理及流程
高效转染病毒
源井生物可以提供不同质量标准的慢病毒，腺病毒，腺相关病毒。
在基因编辑方面，源井生物可以提供体外细胞感染用的浓缩病毒，也可以提供动物体内使用的超纯化病毒，满足客户的不同科研需求。
三种病毒的比对:
腺相关病毒包装原理
腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV) 是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。
重组腺相关病毒（recombinant AAV, rAAV）是利用
AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体，可将目的基因的CDS 区序列或者RNAi 干扰序列插入rAAV 表达质粒中，包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。
腺相关病毒具有感染温和，免疫原性小，长效稳定表达的特点，主要应用于动物体内注射。
源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。
腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml，可以满足各类整体实验的使用要求。
不同血清型的AAV组织感染嗜亲性各不相同，表现出一定的器官靶向特异性。
下表列举了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性:
产品规格：
服务流程及质量控制：
基因敲除腺相关病毒
源井生物构建基因敲除腺相关病毒载体并包装为腺相关病毒，经过超速离心纯化后，可用于动物定位注射和整体注射实验。
细胞感染腺相关病毒后，可稳定表达gRNA和Cas9蛋白，达到敲除靶基因的目的。
基因敲除腺相关病毒载体选择：
注明| 文章是源井生物原创，转载请注明。
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C保存。
6) 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1) 2) 3) 4) 5)1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达 E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
腺相关病毒包装操作手册
hCHETA-EYFP pHBAAV-hSyneNpHR3.0-EYFP pHBAAV-hSynhChR2(H134R)-mcherry
启动子及其特点
CAG（人巨细胞病毒 启动子 CMV 和鸡 beta-actin 嵌合型启 动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
4) 汉恒生物 AAV-mRFP-GFP-LC3 自噬流监测工具（表 4）
载体 类型 双标 单标
载体名称
pHBAAV-mRFP-GFP-LC3 pHBAAV-GFP-LC3
启动子及其特点
CMV，广谱，强 CMV，广谱，强
标记基因
mRFP/GFP GFP
是否 Cre 依赖 否 否
五、整体实验流程（图 2）
图 1、 AAV2 基因组结构示意图。 四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类：
常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制； AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表 1）； 双标、单标 LC3 自噬流监测工具（见表 2）； 组织特异性 AAV-DIO 载体的定制（原理见附件 2）。 2. 汉恒 AAV 产品特点：
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry
否
pHBAAV-GFAP-ArchT-
抑制
EYFP
否
EYFP
GFAP（星形胶质细胞特异
红光 激活
pHBAAV-GFAPC1V1 (t/t)-TS-mcherry
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
腺病毒包装重组的技术详解
腺病毒包装重组的技术详解⼀、什么是⼀、什么是腺病毒包装系统腺病毒包装系统1. 腺病毒包装系统包括：1)1个腺病毒载体：含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。
2)l 株包装细胞株：表达El 基因的293细胞。
野⽣型腺病毒基因组是⼀条约36 kb 的线性双链DNA (dsDNA)分⼦。
基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR)，末端之间含有腺病毒DNA 复制所需基因。
在病毒DNA 复制周期早期表达的基因，称为早期基因，主要有4个，按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。
在病毒DNA 复制周期晚期表达的基因，称为晚期基因，主要有5个，按表达先后顺序依次为Ll 、L2、L3、L4、L5。
为了制备出⾃我失活的重组腺病毒，E1基因会被删除，使重组腺病毒成为⼀种安全的基因运输⼯具。
为了增加包装能⼒，E3基因也同时被删除，因为E3基因产物会提⾼宿主的免疫反应，⽽且对病毒⽣产不重要。
缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。
El 基因⽚段被整合到293细胞基因组中，包装病毒颗粒时，Pacl 消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。
El 基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达，这些基因表达产物和Pacl 消化的质粒DNA 组装成病毒颗粒。
⼆、什么是⼆、什么是腺病毒过程腺病毒过程⽣产携带⽬的基因的重组腺病毒颗粒，过程如下图：将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，再转染线性化DNA到包装细胞。
线性化双链DNA分饰两个⾓⾊，既是病毒基因组，⼜是病毒蛋⽩表达所参照的基因模板序列。
基因组与病毒蛋⽩组装成病毒颗粒，病毒颗粒在细胞内成熟后，使得细胞破裂，从⽽使病毒颗粒释放到培养液中。
然后收集细胞和培养液，反复冻融细胞和培养液的混合物，离⼼收集上清，获得粗病毒。
此时的粗病毒量通常不会很⾼，⼀般会将粗病毒感染更多的包装细胞，以扩增病毒量。
SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染
（ ｅａｔｅｔｆＰ ｔｏｈｓ ｌ ｙ Ｈ ｒｎＭｅｉ ｌ ｎｖｒｔ， ａｂｎ１０ ８ ， ｈｎ ） Ｃ ｉａ ｍ ｏｇ ｉ ａ Ｕ ｅｉ
Ａｂｔａ ｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ａｋ ｇ ｄＧ ＰＳ Ｐ２ ａｄＡ — Ｆ —Ｈ －一７ Ａ ａ ｄａ ｌｙＡ － Ｆ ｎ ｓｒｃ ： ｊｃｉ ｏｐ ｃ ａｅＡ — Ｆ —Ｈ － ｎ ｄＧ ＰＳ Ｐ２Ｅ ６ ｎ ｍｐｉ ｄＧ Ｐ ａ ｄ ｖ ｆ
张 力 李全风 ， ， 李 弘， 王丽娜 ， 金成艳 ， 董红岩 ， 王秀丽， 张丽景 ， 王果元 ， 徐长庆 ， 田 野
（ 哈尔滨医科大 学 病理 生理 学教研 室， 黑龙江 哈尔滨 １０ ８ ） ５０ １
［ 要］ 目的 采用 Ｈ Ｋ ９ 摘 Ｅ ２ ３细胞包装 Ａ ．Ｆ －Ｈ － ｄＧ ＰＳ Ｐ２和 Ａ － Ｆ —Ｈ －一７ Ａ并扩增 Ａ ・Ｆ ｄＧ ＰＳ Ｐ２Ｅ ６ ｄＧ Ｐ重组腺病毒并感 染 乳 鼠心 肌细胞 。方 法 纯化两种载体 ；ａ 酶 切线性化 ； Ｐ ｃＩ 线性 化 的载 体转染 人 Ｈ Ｋ ９ Ｅ ２ ３细 胞进行包 装 ； 从病变 的 ＨＥ ２ ３细胞分离重组腺病毒 。利用重组 的腺病毒感染乳 鼠心 肌细胞 ， Ｋ９ 并在荧光显微 镜下观察绿 色荧光 蛋 白的表
Ｐａ Ｉｅ ｚ ｍｅ ｈ ｎ ａｉ ｄｖ ｃｏ ｓｔ ｎｆｃｅ ｎｏＨＥ ９ ｅｌ．Ａｄ ｎ ｖｒ ｓｐ ｒｉｌｓｗｅｅｉ ｌ— ｃ ｎ ｙ ．Ｔ ｅｌ ｅ ｒｚ ｅ ｔｒ ｒ ｓｅｔｄｉｔ Ｋ２ ３ ｃ ｌ ｉ ｅ ｗａ ａ ｓ ｅ ｏ ｉ ａｔ ｅ ｒ ｏａ ｕ ｃ ｓ
药品包装设计注意事项
药品包装设计注意事项药品包装设计是药品的重要组成部分，良好的包装设计可以增加药品的吸引力，提升品牌形象，同时还能确保药品的安全性和使用方便性。
以下是在进行药品包装设计时需要注意的几个方面：1、符合规范：药品包装设计必须符合国家相关法律法规的规定，以及相应的行业标准和规范。
例如，必须标明药品的名称、生产日期、有效期、成分、用法用量、禁忌等基本信息。
同时，包装材料和印刷工艺的选择也应该符合相关规定。
2、易于识别：药品包装设计应该简洁明了，易于识别。
这可以帮助消费者在第一时间判断药品的种类和用途，从而方便快捷地选择所需药品。
3、外观整洁：药品包装设计应该追求整洁、干净的感觉，避免过于复杂或花哨的设计。
这样可以提高药品的整体美感，同时使消费者更加信任药品的质量。
4、明确用途：药品包装设计应该将药品的用途明确标注。
例如，如果是治疗感冒的药品，应该在包装上明确标注“感冒用药”，使消费者一目了然。
5、信息清晰：药品包装设计应该将药品的基本信息清晰地标注在包装上，包括药品的名称、成分、用法用量、有效期等。
此外，还应该包括生产厂家、批号等相关信息。
6、突出特点：药品包装设计应该将药品的特点和优势突出表现出来，例如药品的剂型、独特的配方、主要功效等。
这样可以提高药品的吸引力，增强消费者的购买欲望。
7、容易打开：药品包装设计应该方便消费者打开。
例如，可以采用易拉环、按扣等设计，使消费者能够轻松打开药品包装。
8、方便携带：药品包装设计应该考虑到方便携带。
例如，可以设计成小巧轻便的形状，或者配备便携式的口袋或夹子等。
9、防止儿童误食：药品包装设计应该考虑到儿童安全问题，防止儿童误食药品。
例如，可以采用防儿童开启的瓶盖设计，或在包装上印制相关警示语和安全提示。
这样可以有效避免儿童误食药品而造成不必要的伤害。
综上所述，药品包装设计是确保药品质量和安全使用的重要环节。
在进行药品包装设计时，要全面考虑多个方面的问题，确保包装设计符合相关规范和标准，同时能够吸引消费者并方便使用。
腺病毒的包装步骤 自己总结 很详细
Adenoviruses Expression System1、从NCBI网站上查找相应基因（如小鼠KL14基因）的编码区，即CDS序列。
2、根据KLF14 CDS设计相应的引物，PCR来扩增KLF14的编码序列，即KLF14的cDNA3、将扩增出来的cDNA序列连接到PGEM-Teasy载体，蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌，提质粒，EcoR I 酶切鉴定，然后送测序4、测序正确后用限制性内切酶把cDNA切下来连接到pcDNA3.1载体(很重要的一种表达载体)上，做报告基因实验。
5、双荧光报告基因检测其对下游的靶基因启动子有作用以后，用合适（HindIII和XhoI）的限制性内切酶将连接到pcDNA3.1上的KLF14 cDNA切下来，凝胶回收，同时也切pAdTrack-CMV 回收。
把KLF14 cDNA连接到pAdTrack-CMV载体上。
6、在包装腺病毒之前要先用western检测一下连接到pAdTrack-CMV的KLF14的cDNA能否表达出蛋白。
把第5步连接好的质粒用转染试剂转染293A细胞，然后收细胞（RAPI裂解液，加蛋白酶抑制剂），提取蛋白，做western，杂标签抗体（Myc或Flag）。
只有在293A细胞有表达之后才可以继续包装。
7、在第5步最好多提取一些连接好的KLF14 cDNA-CMV质粒，浓度高点。
然后用PmeI酶切，让这个质粒线性化（大概要切10ug左右，50ul的体系）。
然后跑胶回收切开的质粒，一般PmeI都可以完全切开，大概要回收3-4ug。
8、将回收的线性化产物加入到BJ5183感受态细菌中（该细菌中已经含有pAdEasy-1质粒），电转化让其发生重组。
然后在kanamycin抗性的平板上筛选，就按一般的热激，涂板的方法转化就可以。
因为重组后的pAdTrack-CMV-KLF9+ pAdEasy-1非常大，大约41.5kb，所以要差不多在37度细菌孵箱中生长16-20h才可以，即使长出菌落，也是非常小的那种。
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
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1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C 保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
腺病毒包装 SOP
腺病毒包装标准操作细则1. 目的：规范腺病毒包装标准操作程序2. 范围：适用于腺病毒包装操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、，移液枪（量程1000μL）、10cm培养皿、各种枪头，1.5mL EP管、15ml离心管，试管架，酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、超净工作台3.2溶液准备DMEM培养基，Opti-MEM，Lipo转染试剂，HEK293细胞，重组腺病毒穿梭质粒，重组腺病毒骨架质粒，FBS(Gemini)3.3操作步骤3.3.1转染前24 小时，用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，以含10% FBS的DMEM培养基调整细胞密度约6*105/ml（70%汇合率的细胞），接种于6孔培养板，37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h 左右，待细胞密度达到70%时即可用于转染。
细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
3.3.2 转染前2 h内将细胞培养基更换为1.5ml Opti-MEM。
3.3.3将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取10 l Lipo转染试剂加入到无菌的1.5ml EP管中与240 μl OMEM混合，在室温下温育5分钟。
3.3.4向另一无菌1.5ml EP管中加入3ug重组腺病毒质粒骨架质粒和1.5ug穿梭质粒与OMEM混合均匀，调整总体积为250 μl。
3.3.5把稀释后的DNA与稀释后的Lipo转染试剂进行混合，用移液器轻轻反复吹吸地混匀，不要振荡。
3.3.6混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipo的转染复合物，将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至HEK293细胞的培养液中，混匀，细胞于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中孵育6h～8 h。
3.3.7 培养6h-8h后，弃去含有转染混和物的培养基,然后每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基2ml，37℃、5%CO2培养箱内继续培养。
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在293细胞中大量扩增腺病毒一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293 细胞中进行大量扩增。
本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011～3×1012。
由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000～10000，因此1L 培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。
如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。
对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。
为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。
如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。
注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。
每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤：1 在100mm 培养皿或75cm2培养瓶中加入10mlDMEM5%培养5×106293 细胞。
2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI 值约为5。
3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3 次，37℃ CO2 孵箱中培养90 分钟。
4 加入9ml DMEM5%。
5 再培养72 小时，这时在10ml 溶液中大约有5×109～5×1010个病毒颗粒，进行MOI 测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，600×g 离心5 分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。
-200C /370C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
1 -20℃/37℃冻融3 次。
2转入15ml 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。
3 3 个175cm2培养瓶中各加入107 293 细胞进行培养。
4 将3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。
移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml 混合液，十字形慢慢晃动混匀3 次，370C 5%CO2 孵箱中培养90 分钟。
此时MOI 值约为25。
5 加入DMEM5%至30ml。
6 再培养48～72 小时。
此时10ml 培养液病毒量约为3×1010～3×1011。
若需要，进行MOI 测定以估计病毒滴度。
注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。
600×g 离心5 分钟收集细胞，弃上清，加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。
-200C /370C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。
12. 移入50ml 离心管中，台式离心机上最大速率离心10 分钟，取出上清保存。
13. 30 瓶175 cm2 培养瓶中每瓶各加入107 293 细胞。
14. 将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3 次混匀，370C 培养90 分钟。
此时MOI 值约为25。
15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。
16. 再培养48-72 小时，此时约有3×1011～3×1012个病毒。
若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度。
如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5%中。
-200C /370C 冻融3 次，离心沉淀细胞碎片。
此时5ml DMEM5%中3×1011～3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010～6×1011vp/ml。
然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。
在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010 细胞中扩增则有一定技术性。
切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA 产生量。
有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA 产量。
如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。
如果需要大于扩增4 轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。
比如，用第2 代病毒产生第3 代病毒。
如果没有第2 代病毒，那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。
按这个原则进行扩增可使RCA 水平尽可能低。
如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。
细胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。
2.5.2 转染具体操作按TransFastTM Transfection Reagent（Promega）的操作手册进行。
转染在24孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化HEK-293A细胞，用10%的新生牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5×105个细胞/mL，在24孔细胞板上每孔接种1.0mL，5%CO2、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出－20℃保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入200μL 37℃预热的OPTI-MEM无血清培养基（或不含血清的DMEM），然后加入1.0μg的DNA，混匀后加入3.0μL的TransFastTM Transfection Reagent（使lipid∶DNA的体积/μL与质量/μg比为1∶1）后立即涡漩，在室温温育TransFastTM Transfection Reagent/DNA混合物l0～15min；从二氧化碳细胞培养箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩TransFastTM Transfection Reagent/DNA混合物，把混合物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落；轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h后，轻轻加入1.0mL 37℃预热的完全生长液（或使血清浓度降到2～6%），把细胞放入二氧化碳培养箱，37℃培养7～14d。
2.5.3 重组腺病毒的收获与增殖当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）或细胞状态不足以维持时，－20℃冻存收获病毒。
冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37℃吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液（含2%血清的DMEM），增殖病毒。
线性DNA转染只有在包装成病毒后才能表达GFP，至少也得5d左右一般短时间病毒可以保存在-20度，但是病毒最好在-80℃保存，特别是纯化之后。
在最佳的缓冲液（10mM Tris HCl pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4% sucrose）病毒会持续1-2年稳定性；病毒不能反复冻融；建议不要在-20℃下长期保存。
病毒在DMEM中用血清保存的方式与纯化颗粒一致，但通常比在缓冲液中更加稳定。
可以在DMEM中用血清在4℃存储病毒一周以上而不需要反复冻融。
病毒在DMEM中可以反复冻融30次以上而滴度不会下降，在经过纯化的病毒的情况下，使用缓冲液存储于-80℃下滴度就会至少下降一个数量级（视保存缓冲液而定）。
缓冲液和精确的PH值对于滴度的保存是很关键的。
最佳的保持稳定性的储存方法建议使用以下缓冲液：Tris 10mM ,pH 8.0, 2 mM MgCl2 ，4% sucrose一般转染后几天之内可以看到零星、散在的荧光，在转染后5d以后，如果有腺病毒包装，由于其感染周围的细胞，那么会在腺病毒包装的地方看到荧光数增加，聚集成一团的样子。
随着时间的延长，整个视野荧光数会逐渐增多。
转染后荧光数不增加或不明显，这与病毒包装的过程有关。
如果包装很快，那么很快就能看到明显的荧光。
毕竟不同转染条件、不同目的基因，包装速度是不一样的。
如果细胞没有CPE，细胞状态好的话，可以尽可能地将时间延长，一直维持就可以。
有时候第一代都看不到明显的CPE，等细胞不能维持时，冻融再接一代有时就明显了。
刚转染之后也能看到散在的荧光，包装成功是能看到成团的荧光，当然CPE 是最确切的证实。
能否包装成功与目的基因也有很大关系，据不完全统计，在腺病毒包装公司，大约有将近10%是不能成功的。
当基因对腺病毒有害时常常会出现这种情况。
时间长短与你的转染量、转染效率、基因都有关系。
CPE的具体表现为：细胞变圆、脱落，形成空斑。
有时候第一代很难看到，最后时间长了，与对照细胞差别不大，往往病变难以确定，需要传代一次才会变得明显。
液体变黄是正常的，只要感觉细胞还行就可以。
这个过程一般不需要换液，细胞好可以维持12d都可以。
如果觉得不能维持了，可以换液，因为此时上清的病毒很少（多的话，早就有CPE了）。
即使到后来，也是细胞中的病毒量高。
我的质粒提取方法重组质粒的小量提取1.挑取转化DH5a的单个菌落，接种于盛有3.0mL的含50μg/mL（或加倍）氨苄青霉素的LB培养基的试管中，37°C 220rpm过夜振荡培养（一般12-16h，如果浓度低可适当延长时间）；2.取1.5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体（我一般重复2次，也就是3ml离心在一个EP管；试剂盒提我重复4次，也就是说6ml过一个柱子）；（不用担心裂解不开）3.完全弃去上清后加入300μL 4℃预冷的溶液I（50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris-Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA）重悬细菌；4.加入新配制的溶液II 300μL（0.2mol/L NaOH；1%SDS），缓慢颠倒离心管数次，将离心管置于冰上；5.加入225μL用冰预冷的溶液III（5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5Ml），盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上3～5min；6.12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中；7.加入1-2μL RNase A（10mg/mL），37℃作用30min或延长至60min；8.加入600μL的酚∶氯仿，颠倒混匀后置室温5min，12000rpm离心 5min；9.取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；10.12000rpm离心l0min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加入30μL 双蒸水溶解；11.琼脂糖凝胶电泳分析。
转染后48h看不到荧光也算是正常的，但是细胞第7天就死亡肯定是不正常的。