紫外分光光度法和荧光分析法

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环境监测常用分析方法简介

环境监测常用分析方法简介环境样品的测试方法是在现代分析化学各个领域的测试技术和手段的基础上发展起来的，用于研究环境污染物的性质、来源、含量、分布状态和环境背景值。

随科学技术的不断发展，除经典的化学分析、各种仪器分析为环境分析监测服务外，一些新的测试手段和技术，如色谱-质谱联用、激光、中子活化法、遥感遥测技术也很快被广泛应用于环境污染的监测中，为了及时反映监测对象和取样时的真实情况，确切掌握环境污染连续变化的状况，许多小型现场监测仪器和大型自动监测系统也获得迅速的发展。

一、化学分析法是以特定的化学反应为基础的分析方法，分重量分析法和容量分析法两类。

重量法操作麻烦，对于污染物浓度低的，会产生较大误差，它主要用于大气中总悬浮颗粒、降尘量、烟尘、生产性粉尘及废水中悬浮固体、残渣、油类、硫酸盐、二氧化硅等的测定。

随着称量工具的改进，重量法得到进一步发展。

例如，近几年用微量测重法测定大气飘尘和空气中的汞蒸汽等。

容量法具有操作方便、快速、准确度高、应用范围广、费用低的特点，在环境监测中得到较多应用，但灵敏度不够高，对于测定浓度太低的污染物，也不能得到满意的结果。

它主要用于水中的酸碱度、NH3-N、COD、BOD、DO、Cr6+、硫离子、氰化物、氯化物、硬度、酚等的测定，及废气中铅的测定。

二、光学分析法是以光的吸收、辐射、散射等性质为基础的分析方法，主要有以下几种：（一）分光光度法是一种具有仪器简单、容易操作、灵敏度较高、测定成分广等特点的常用分析法。

可用于测定金属、非金属、无机和有机化合物等。

在国内外的环境监测分析法中占有很大的比重。

（二）原子吸收分光光度法是在待测元素的特征波长下，通过测量样品中待测元素基态原子（蒸气）对特征谱线吸收的程度，以确定其含量的一种方法。

此法操作简便、迅速、灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、测定元素范围广，是环境中痕量金属污染物测定的主要方法，可测定70多种元素，国内外都用作测定重金属的标准分析方法。

紫外分光光度法和荧光分析法

差示分光光度法
▪ 一般分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大旳误差。需采用示差法。
▪ 即提升入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度旳原则溶液作参比溶液。
▪ 设：待测溶液浓度为cx，原则溶液浓度为 cs(cs < cx)。则：
▪ Ax= εb cx As = εb cs
4.构造分析
▪ 1.鉴别物质旳异构体，如互变异构体，顺反异构体，开链和成环异构体，旋光异构体，空间异构体等。反式异构体空间位阻小，共轭程度较完全。最大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数，不小于顺式。
▪ 2.推测物质旳共轭体系和部分骨架 ▪ 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等
多种仪器联合作物质旳构造分析。
▪ 激发单色器：置于光源和样品室之间旳为激发单色器或第一单
色器，筛选出特定旳激发光谱。
▪ 发射单色器：置于样品室和检测器之间旳为发射单色器或第二
单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定旳发射光谱
▪ 样品室：一般由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样
品)构成。
▪ 检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大
并转为电信号。
荧光分析法与紫外-可见分析法异同点
荧光分析法与紫外-可见比较：均属于分子光谱仪器构造基本相同
荧光
可见-紫外
本质
发射光谱
吸收光谱
敏捷度选择性
10-10-10-12 g/ml 高
10-4-10-7g/ml 一般
应用
硫色素荧光法测定维生素B1
维生素B1 在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，在紫（365nm）
②物质对光吸收呈加和性旳原理，即在某一样品旳吸收曲线上，各波长旳吸光度是维生素A与杂质吸光度旳代数和，因而吸收曲线也是两者吸收旳叠加。

荧光分析法知识讲解

荧光分析法荧光分析法●习题精选一、选择题（其中1~6题为单选，7~10题为多选）1．下列化合物中荧光最强、发射波长最长的化合物是( )。

A. B.C. D.2．所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光( )。

A. 波长长的光线；B. 波长短的光线；C. 能量大的光线；D. 频率高的光线3．单光束荧光分光光度计的光路图是( )。

A.B.C.D. 4A. 1-氯丙烷；B. 1-溴丙烷；C. 1-碘丙烷；D. 1,2-二碘丙烷5．下列化合物荧光最强的是( )；磷光最强的是( )。

Cl BrA B C D I6．下列化合物荧光量子产率最大的是( )A B C DCOO H-COO O -O OH COO HO OH O OCOO -O -O -7．下列说法正确的是( )A 荧光发射波长永远大于激发波长B 荧光发射波长永远小于激发波长C 荧光光谱形状与激发波长无关D 荧光光谱形状与激发波长有关8．荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是( )A. 单色光；B. ECl ≤0.05；C. 入射光强度I 0一定；D. 样品池厚度一定9．下列化合物中可产生荧光的化合物是( )A BC DNN N N10．在相同条件下，荧光、延时荧光、磷光三者波长之间的关系为( )A. 荧光波长与延时荧光波长相等；B. 磷光波长比荧光波长、延时荧光波长长；C. 磷光波长与延时荧光波长相等；D. 磷光波长比荧光波长、延时荧光波长短二、填空题1．荧光寿命与延时荧光寿命相比，寿命短；荧光寿命与磷光寿命相比，寿命长；磷光寿命与延时荧光寿命相比，二者。

2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状，常形成。

3．一般情况下，溶液的温度，溶液中荧光物质的荧光强度或荧光量子产率越高。

4．激发光谱的形状与光谱形状极为相似，所不同的只是。

5．荧光分光光度计中光源与检测器呈角度。

这是因为。

6．紫外分光光度计与荧光分光光度计的主要区别是（1）。

食品中2,3-丁二酮形成机制和检测方法综述

食品中2，3-丁二酮形成机制和检测方法综述食品中2，3-丁二酮形成机制和检测方法综述本文关键词：综述，检测方法，机制，食品，丁二酮食品中2，3-丁二酮形成机制和检测方法技术手段综述本文简介：2，3-丁二酮又名双乙酰、丁二酮，是一种黄色至浅绿色且具有强烈奶油香味的突出香料。

2，3-丁二酮天然存在于发酵乳制品和啤酒啤酒等发酵橙汁中，1983年被美国食品药品监督管理局(FDA)规定为GＲAS级(generallyrecognizedassafe)，普遍用作焙烤食品、非酒精饮料、糖果、乳制品替代品食品中2，3-丁二酮形成机制和检测方法综述本文内容：2，3-丁二酮又名双乙酰、丁二酮，是一种黄色至浅绿色浓厚且具有强烈奶油香味的重要香料。

2，3-丁二酮天然存在于发酵乳制品饮品和啤酒等发酵饮料中，1983年被翌年美国食品药品监督管理局( FDA) 规定为 GＲAS级( generally recognized as safe) ，广泛用作焙烤食品、非酒精饮料、糖果、乳制品替代品、奶油等食用油的风味物质［1 －4］。

最近的研究表明，2，3-丁二酮具有细导至闭塞性细支气管炎、诱导氧化应激等毒性作用，食品中 2，3-丁二酮的安全性问题引起了国内外的广泛关注［5 －6］。

本文综述了食品中 2，3-丁二酮形成机制和检测方法方面的研究进展。

1 食品中 2，3-丁二酮形成机制在食品加工进程中，2，3-丁二酮的形成途径主要包括脂质氧化、糖类分解、美拉德反应、微生物发酵和核黄素光敏氧化等。

1. 1 脂质氧化富含脂肪酸的食品在烹调和热加工过程中能够产生 2，3-丁二酮等羰基化合物，其可能反应途径见图 1［4］。

不饱和脂肪酸在超氧阴离子( O－2·) 、单线态氧(1O2) 、羟自由基( ·OH) 等活性氧作用下发生过氧化反应，形成氢过氧化物、环氧化合物等中间产物，中间产物能能够集中精力反应并生成 2，3-丁二酮等活性烷基化合物［3，7］。

生物样品的常用分析方法

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气相色谱法 (gas chromatography，GC) 缺点：
要求被测药物及其代谢物必须具有一定的挥发性和热稳定性。
解决方法：
固定相发展和衍生化试剂的广泛使用，使生物样品不再受限制。
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气相色谱法 (gas chromatography，GC)
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高效液相色谱法
液-固吸附色谱法液-液分配色谱法离子交换色谱法
分离方法
凝胶排阻色谱法
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高效液相色谱法色谱分离方法的选择主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。
体内药物分析是借助于现代化的仪器与技术来分析药物在体内数量与质量的变化，以获得药物在体内的各种药代动力学参数、代谢方式、代谢途径等信息。目前，用于生物样品分析的方法有很多，归纳起来主要有以下几类：
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生物样品的常用分析方法
1. 色谱分析法 2. 光谱分析法
3. 免疫分析法
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荧光分析法（三）荧光探针分析法
（Fluorescence method）局限衍生化增加分析步骤，易引入分析使用荧光探针从无荧光的药物制备有荧光误差。的衍生物。
优点
1
2
3
增强待分析物质的荧光响应，提高检测灵敏度和选择性。
稳定分析物，有助于化合物基团的确尤其针对活证。泼的和有挥发性的化合物。
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高效液相色谱法一、相对分子质量

荧光分析法实验(有思考题答案)

实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量五．数据处理1．用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。

2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。

在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。

苯丙氨酸的荧光光谱图苯丙氨酸扫描激发波长在214nm和285m两处出现最高峰，本实验选择214nm为最大激发波长。

此外，激发波长曲线在280－300nm处出现了一个十分完美的峰，此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证，如图，我们通过同步扫描荧光光谱技术获得的激发波长也在215nm，与之前基本吻合。

色氨酸的荧光光谱图色氨酸扫描激发波长在217nm处有一个最大峰，所以激发波长为217，发射波长为361。

发射波长曲线在450－460nm处出现了一个十分完美的峰（在这张图上没显示出来），此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证。

六．讨论与思考1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？从预扫描得到激发和发射波长的初步结果，根据我们得到的初步结果对仪器进行设置，然后对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。

2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现以很强的峰，是倍频峰。

不适合定量分析。

3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。

同步荧光法能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响，提高对荧光性质相近化合物同时测定的选择性和灵敏度。

同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱，得到的峰比较窄，更明显。

同步荧光光谱不是荧光物质的激发光谱和发射光谱的简单叠加。

在选合适的扫描波长差值的情况下，同时扫描激发光谱和发射光谱重叠波长处，才同时产生信号，4．通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法和分子荧光光度法，是两种现代分析化学中常用的光度测定技术，它们之间有许多不同之处。

首先，紫外可见分光光度法可以用来测量悬浮液和溶液中某种物质含量，通过检测它
们吸收波长不同的光，并使用紫外可见分光仪可以很好地用来定量分析一种物质的含量，
主要原因是它可以采用强度谱的方式测定光谱分析，这是数据量最大的分光光度法。

而分子荧光光度法则与紫外可见分光光度法存在很大的不同。

分子荧光光度法是一种
用于测定物质的定量分析的光度测量技术，其原理是通过激发某种物质的激发状态，并采
用光谱分析的方式测定淬发状态下某种物质吸收的光谱，采用发射率谱测量它发射出来的
光谱，这种方法有利于识别样品中含量很小的物质。

此外，两种光度测量技术在检测样品中的某种物质的含量时也有很大的差异。

紫外-
可见分光光度法通常可以测到复杂样品中有结构特性的物质，因此适用于分析各种复杂混
合样品，分子荧光光度法则是通过向某种物质添加少量共振激发剂来标记样品中某种物质，然后进行定量分析，它可以清楚地测量某种独特结构物质，因此被广泛应用于纯化和同位
素比值等细胞研究中，并可以更明确地测量和筛选出某种物质。

综上所述，紫外可见分光光度法和分子荧光光度法是两种现代分析化学中常用的光度
测定技术，它们在原理，应用，检测样品中含量的某种物质等方面都存在差异，根据实际
情况和需要，可以依据自身需要选择不同的光度测量技术，以获得更准确的定量分析结果。

叶酸的检测方法

叶酸的检测方法作者：王娜娜来源：《教育周报·教育论坛》2020年第11期摘要：目前已经发展的一些叶酸检测的方法各不相同，主要根据测定式样来决定其测定方法，最早发展的是微生物法，灵敏度高，但重复性相对较差，主要有比色法、紫外分光光度法、荧光分析法等等。

关键词：叶酸检测方法微生物法微生物法的检测原理为酪乳酸杆菌的生长必需叶酸，培养基中若缺乏叶酸则该细菌不能生长。

在一定的条件下，酪乳酸杆菌的生长及其代谢产物的浓度与培养基中叶酸的含量成正比关系，可测定细菌代谢物或菌体的浓度，即用酸度或浑浊度测定试样中叶酸的含量。

荧光法超声氧化荧光法叶酸自身荧光很弱，在中性介质中经超声照射后，能被氧化成喋呤羧酸，其荧光强度在462 nm波长处比叶酸自身有显著提高。

基于以上现象，建立了一种超声氧化预处理，荧光检测叶酸的方法。

荧光分光光度法本法利用高锰酸钾在酸性介质中氧化叶酸为1-氨基-4-羟基喋吮-6-叶酸后，其荧光强度可以测定复方制剂中叶酸的含量，其他维生素可用硅藻土吸附除去，本法灵敏度较高，可测得0. l ug/ml的叶酸。

衍生荧光法在酸性条件下，用强氧化剂氧化叶酸，并于254 nm紫外光下照射30 min，其氧化产物均具有强的荧光性质，因此荧光强度大大增强，比叶酸自身灵敏度提高2-3个数量级。

实验结果表明：高锰酸钾氧化一光照体系检出限为3.2 x10 -9mol/L，过氧化氢氧化一光照体系检出限为6. 5 x 10 -9mol/L。

离子捕获法1995年，wilson等提出了离子捕获法检测叶酸。

即在实验中，样品中加入变性剂后，叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸（叶酸的类似物）结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探测，定量分析样品中叶酸的含量。

色谱法高效液相色谱法在薄膜强阴离子交换树脂（0.01 *300cm pellicular）柱上用氯化钾一磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）在40℃的温度下进行梯度洗脱，可将三经基叶酸（THF）， N5-甲基一三经基叶酸（N5-CH3， -THF），去氢叶酸（DHF）、叶酸（FA）等异构体的混合物分离，洗脱的顺序是：THF， N5- CH3 -THF， DHF， FA。

荧光分析法比紫外-可见分光光度法灵敏度高的原因

荧光分析法比紫外-可见分光光度法灵敏度高的原因
答：荧光分析中与浓度有关的参数是银光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，即在黑暗背景下检测所发射的强度信号，因此可采用增强入射光强度或增大检测新还得放大倍数来提高灵敏度；
在分管光度法中与浓度相关的参数是吸光度，如果正大入射光强度，相应也增大了透射光强度，同样不能提高其比值；如果增大检测器放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度同时增大，比值同样不增大，也就不能达到提高灵敏度的目的，所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分管光度法高。

紫外分光光度法和荧光分析法..

波长紫外可见分光光度计
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液在432nm处有最大吸收，而地蒽酚在该处几乎无吸收。
双波长分光光度法
不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两
束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。 ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度成正比（例子：课本366页）
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即
IF=KC
光照分子基态辐射跃迁荧光激发态
若光源是：
由荧光波长可确定物质分子可见-紫外光源分子荧光分析法具有结构由荧光强度可测物质的含量原子特征光谱作光源原子荧光分析 X射线作光源 X射线荧光分析
其他
卡尔曼滤波法
偏最小二乘法小波变换
三波长分光光度法
系数倍率法
……
原理与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光 — 分子吸收电磁波后，从其最低激发态重新发射紫外线或可见光的现象利用某些物质被一定波长的光照射后所产生的，能够反映该物质特性的荧光来进行定性定量的分析方法——荧光分析法。
导数分光光度法
导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、

特殊杂质检查方法

（五）对光吸收性质的差异
1.紫外分光光度法 1.紫外分光光度法 2.原子吸收分光光度法 2.原子吸收分光光度法 3.红外分光光度法 3.红外分光光度法 4.荧光分析法 4.荧光分析法
1.紫外分光光度法 1.紫外分光光度法
当杂质在某一波长处有最大吸收，当杂质在某一波长处有最大吸收，而药物在此无吸收时，而药物在此无吸收时，可以通过控制供试品溶液在此波长处的吸收度来控制杂质的量。制杂质的量。举例：举例：规定葡萄糖注射液在 284nm波长处的吸收度不得过波长处的吸收度不得过0.32，波长处的吸收度不得过，即可控制其杂质5-羟甲基糠醛的量羟甲基糠醛的量。即可控制其杂质羟甲基糠醛的量。
（六）吸附或分配性质的差异
1.薄层色谱法 1.薄层色谱法（1）杂质对照品法（2）供试品自身对照法（3）对照药物法 2.纸色谱法 2.纸色谱法 3.高效液相色谱法 3.高效液相色谱法 4.气相色谱法 4.气相色谱法
（1）杂质对照品法
适用于已知杂质并能制备杂质对适用于已知杂质并能制备杂质对已知杂质照品的情况。照品的情况。要求供试品与所检杂质对显色剂所显的颜色应相同，颜色应相同对显色剂所显的颜色应相同，显色灵也应相同或相近。敏度也应相同或相近敏度也应相同或相近。方法：根据限量，方法：根据限量，取供试品溶液和限度量的杂质对照品溶液，限度量的杂质对照品溶液液和限度量的杂质对照品溶液，分别点样于同一硅胶薄层板上，展开、点样于同一硅胶薄层板上，展开、定位、检查，供试品中所含杂质的斑点，检查，供试品中所含杂质的斑点，不得超过相应杂质的对照斑点。不得超过相应杂质的对照斑点。
（二）颜色的差异
某些药物自身无色，某些药物自身无色，但从生产中引入了有色的有关物质，产中引入了有色的有关物质，或其分解产物有颜色。其分解产物有颜色。

生物分析实验一_紫外分光光度法与荧光分析法

三、被测样品的要求
1、含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。
2、当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求
四、定性分析
根据物质的吸收光谱的特征吸收光谱的形状、吸收峰的数目、吸收峰的位置（波长）、吸收峰的强度、相应的吸光系数进行定性分析。
CX=(AX/AR)CR CX为供试品溶液的浓度； AX为供试品溶液的吸收度； AR为对照品溶液的浓度； CR为对照品溶液的吸收度。
2、吸收系数法
按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。
CX

AX
/(E
1%
1cm
100)
EHale Waihona Puke 1% 1cm紫外分光光度法与荧光分析法
紫外分光光度法
一、紫外分光光度法的特点
1、灵敏度高，可达10-4~10-7g/ml 2、准确度高，相对误差为2%~5% 3、仪器价格较为廉价，操作简单 4、应用广泛（可以用此法不经分离直接测定混合物中各组分含量）
二、紫外分光光度计
光源
氢、氘灯;可发射185～400 nm的连续光谱
单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。
样品室
样品室放置各种类型的比色皿。比色皿材质主要有石英和玻璃两种。在紫外区须采用石英比色皿。
检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
显示
由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动。因此，除了定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。

紫外分光光度法和荧光光度法的对比

紫外分光光度法和荧光光度法的对比
紫外分光光度法和荧光光度法是两种不同的光学分析方法，下面进行一些对比：
1.原理：紫外分光光度法基于物质对于紫外光的吸收特性，而荧光光度法基
于物质在特定波长的光的作用下产生的荧光效应。

2.应用范围：紫外分光光度法常用于测定物质在紫外区的吸收光谱和吸光度，
适用于有机化合物、络合物等；而荧光光度法常用于测定物质在可见光区的荧光光谱和荧光强度，适用于荧光物质、高灵敏度分析等。

3.灵敏度：荧光光度法的灵敏度通常比紫外分光光度法高，可以检测到更低
浓度的物质。

4.干扰因素：紫外分光光度法受到溶剂、pH值等干扰因素影响较大，需要精
心选择和调节；而荧光光度法受到的干扰因素相对较少。

5.样品要求：紫外分光光度法对样品的纯度要求较低，可以直接测定；而荧
光光度法对样品的纯度要求较高，需要预先进行提纯和浓缩。

6.测量时间：紫外分光光度法测量时间较短，可以快速得到吸收光谱和吸光
度；而荧光光度法测量时间较长，需要等待样品达到稳态荧光。

综上所述，紫外分光光度法和荧光光度法各有其优缺点，根据具体的分析需求和样品特性选择合适的方法。

荧光法

荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。

2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。

3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。

（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。

5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。

（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。

（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。

（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。

磷光的坡长比荧光更长。

9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。

激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S*1的最低振动能级。

②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。

③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。

10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。

紫外与荧光实验讲义

实验一绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数一.实验目的通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453 UV-V is的使用方法。

学习导数光谱计算方法及特点。

二.实验原理1．本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。

紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm的紫外光谱。

各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。

吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。

为了清楚地描述各种物质对紫外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。

在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。

根据比尔定律：A = ε b c式中A—吸光度ε—摩尔吸光系数b—液槽厚度，单位：厘米c—摩尔浓度，单位：mol/l摩尔吸光系数可按下式计算：ε=A b c实验测得的吸收光谱及摩尔吸光系数与仪器及其狭缝宽度有关。

因此实验结果须注明所用仪器的型号及缝宽条件。

2．导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。

利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。

通常可以获得1-4阶导数光谱。

在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：ssd Acdλ∝。

其中s为导数的阶数。

因此，可以利用导数光谱进行定量测定。

导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。

由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。

三.实验仪器和试剂1.Agilent8453 UV-Vis分光光度计;2.移液枪(德国BRAND公司生产);3.25ml容量瓶，50ml容量瓶10支;4.氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l;5.去离子水四.实验步骤1.波长测定（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为50mg/l, 苯丙氨酸720mg/l；（2）分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm——450nm间测定他们的吸收光谱。

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。

可以从发射光谱或激发光谱进行分析。

组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。

必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。

②单色器。

它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。

③试样容器，又称吸收池。

供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。

容器的光程一般为 0.5～10厘米。

④检测器，又称光电转换器。

常用的有光电管或光电倍增管。

⑤显示装置。

这部分装置发展较快。

较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。

分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。

1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。

常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。

2. 单色器，两个单色器。

3. 样品池通常用石英制成。

4. 检测器：光电倍增管。

常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。

简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。

2.双光束自动记录，快速全波段扫描。

可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。

仪器复杂，价格较高。

3.双波长。

将不同波长的两束单色光(λ、λ1 ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。

化学反应中的紫外光谱分析

化学反应中的紫外光谱分析在化学反应中，紫外光谱分析是一种常见的分析方法。

紫外光谱分析通过测量分子在紫外波长区域内吸收或散射光线的强度，来确定分子结构和化学性质。

在反应过程中，紫外光谱分析可以监测化学反应的进程和反应产物的形成情况，具有很高的应用价值。

一、紫外光谱分析原理在紫外光谱分析中，样品主要是通过吸收紫外光而产生电子跃迁，这种跃迁主要由分子内的非键电子参与。

一般情况下，分子中的σ键和π键吸收能量的波长一般为较长波长，一般在可见光和红外光区域；而非键电子能够吸收紫外光，波长较短，很容易被分析仪器检测到。

紫外光谱分析原理中最重要的是分子间电子的跃迁。

跃迁过程中电子的能量发生变化，需要吸收或者释放能量。

在紫外区域内，分子电子跃迁的能量一般范围在150到400nm之间，其中最常见的是在200到300nm之间。

当紫外光通过样品时，分子内的各种键吸收不同波长的光，通过测量吸收波长和波长的吸光度，可以确定样品中物质的种类和含量。

二、紫外光谱分析用途紫外光谱分析广泛应用于化学、制药、生物等行业中。

在化学反应中，紫外光谱分析可以监测反应产物的形成过程，确定反应物的转化率和反应速率等信息。

此外，紫外光谱分析还可以用于物质的结构分析、质量分析以及溶液的浓度测量等方面。

三、紫外光谱分析方法1. 紫外分光光度法紫外分光光度法是通过测量样品中紫外光吸收的强度来确定其质量浓度的一种方法。

该方法适用于化学反应中液体和气体的分析。

该方法的优点是直接、快捷、准确，但需要选择合适的吸收波长和质量浓度的标准。

2. 红外光谱分析法红外光谱分析法通过测量样品在红外区域内吸收或者散射的光线波长，来确定分子结构和化学性质。

该方法主要适用于分子中的震动和转动模式分析，但对于不同类型的键布局较为敏感。

该方法在反应物分析和反应产物的结构分析方面非常有用。

3. 荧光光谱法荧光光谱法是一种通过测量样品在紫外激发下的荧光强度来确定分子的结构和性质的方法。

荧光分析法

基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：

通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反，电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章荧光分析法
（Fluorescence）
1

分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后，返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光荧光分子荧光光致发光（PL）紫外可见荧光磷光化学发光（CL）红外荧光 X射线荧光电致发光（EL）生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
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4.胶束增敏荧光分析当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束，利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
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荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析