ELISA的原理PPT课件

➢ 竞争法（Competitive ELISA) ：
• 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体
• 检测液相me-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
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酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
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试剂的准备 1.放冰箱内保存的试剂、在使用前应先恢复到室温。 2.仔细检查试剂各组分是否变质。 3.保存试剂的冰箱应定期检查其贮存温度（正常为28℃），并尽量避免冰箱频繁开关。 4.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 5. ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应 为新鲜的和高质量的。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P
✓ 免疫荧光技术：FITC异硫氰酸荧光素，PE藻红蛋白
✓ 免疫酶测定法：HRP辣根过氧化物酶，AP碱性磷酸酶
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免疫酶测定法
(Enzyme Immuno Assay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
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加样:
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底
物。
1． 严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。
2． 使用的微量加样器应注意保养并定期校正。
3． 加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注
意不可出现气泡。加样前要看移液器的液面是否平齐。
4． 加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并
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标本的采取和保存
（3）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。
标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用 ，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不 均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测， 宜少量分装冰冻保存。
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
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酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如 乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。
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标本的采取和保存
（2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。
血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本 底加深，产生假阳性反应。
细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌 的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存 中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完全。
若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不 易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。
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标本的采取和保存
（1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。
血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶 （HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高 ，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而 产生非特异性显色。
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液
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标本的采取和保存
体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（ 20－25℃）放置30－60min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－ 30min，析出血清。
做相应记录。
5． 加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。
6. 如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，避免污染整
条甩掉再重新加。
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温育
抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）
等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体
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④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。
⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据
颜色反应的深浅来定性或定量分析。
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免疫标记
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同 位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标 记物，间接测定未知的抗原或抗体。
1.定义 2.分类
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中 未知抗体或抗原的方法。
➢ 间接法（Indirect ELISA）：
• 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体
➢ 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
• 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原
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酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
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ELISA的试剂
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的
底物。
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）
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ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。 ②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗
体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体） 起反应。