土壤微生物量碳氮测定方法

1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪

一、方法原理

土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。

1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。

2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。

直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。

二、主要仪器

振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。

二、试剂

1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。

2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。

四、操作步骤

称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。

将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。

五、结果计算

土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45

式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。

一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。

六、注意事项

1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。

2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。

3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。

4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。

1.23.2土壤微生物量氮的测定

一、方法原理

土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸

土壤中总氮的差值为基础计算土壤微生物量氮。

二、主要仪器

振荡机、真空干燥器、真空泵、高压锅、紫外可见分光光度计、凯氏定氮仪、连续流动分析仪。

三、试剂

1．氯仿（去乙醇）。

2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液。

3．氧化剂溶液：将6 g NaOH和30 g K2S2O8用水溶解后定容至1 L。

四、操作步骤

土壤微生物量氮的测定采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法。在真空干燥器中用氯仿蒸汽熏蒸24 h，用反复抽真空方法除去残存氯仿后, 再用0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液浸提后振荡30 min，立即过滤，滤出的浸提液测定微生物量氮。测定方法主要有以下3种：

1．氧化法

取10 mL土壤浸提液置于25 mL带塞的刻度试管中，加入等体积的氧化剂溶液，立即加塞，固定好以防加热氧化时塞子冲出。充分混匀后加入高压锅中进行氧化至少0.5 h，取出冷却至室温，在波长220和275 nm下进行比色。

2．凯氏法

浸提液采用凯氏消煮蒸馏法，测定浸提液全氮。分别吸取25 mL的K2SO4浸提液于50 mL 开氏瓶中，加入5 mL 浓HSO4，以防铵的损失。在水浴中加热至体积约1～2 mL。然后加入3 g混合加速剂( K2SO4∶Cu2SO4 =10∶1)和8 mL浓H2SO4，摇匀，在370 ℃消煮至液体变清(约3 h)，冷却后，将消煮液转入凯氏瓶中在定氮仪上蒸馏定氮。

3. 流动分析仪法

土壤熏蒸后，用K2SO4浸提液后，震荡、过滤、用连续流动分析仪测定滤液中的铵态氮。氯仿熏蒸后，死亡微生物的部分氮素会以NH4+-N 形式释放而被0.5 mol·L-1 K2SO4浸提出来；而未熏蒸的0.5 mol·L-1 K2SO4浸提的NH4+-N中不包括这部分。NH3+-N 中不包括这部分。因此熏蒸与不熏蒸的铵态氮之差，是熏蒸所造成的氮增量。

五、结果计算

1．氧化法

土壤微生物量氮=（熏蒸土壤微生物量氮-未熏蒸土壤微生物量氮）/ 0.45

2．凯氏法

土壤微生物量氮=（熏蒸土壤微生物量氮-未熏蒸土壤微生物量氮）× 0.53

土壤微生物量氮=（熏蒸土壤微生物量氮-未熏蒸土壤微生物量氮）× 0.48

3．流动分析仪法

土壤微生物量氮=（熏蒸土壤微生物量氮-未熏蒸土壤微生物量氮）/0.25

微生物体氮的矿化系数K 为0.25，即矿化出来的微生物体氮仅是微生物体总氮的0.25倍。

六、注意事项

1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。

2．打开真空干燥器时，要听声音。如没空气进去的声音，试验需重做。

3．试剂的厂家应注意，有些厂家K2SO4试剂不易浸提土壤微生物量碳。

4．浸提液应尽快测定或在-18℃下保存。