4.1生物成分的分离与测定技术(DNA的粗提取)

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第四章 生物化学与分子生物学技术实践

4.1生物成分的分离与测定技术（DNA 的粗提取）

探究目的：

1．说出DNA 的物理、化学性质。 2．概述DNA 粗提取和鉴定的原理。

3．尝试对动物或植物组织的DNA 进行粗提取。

探究预习：DNA 的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA 的有,效提取要求材料中的DNA 尽可能少的,降解。不同的研究目的对DNA 的纯度,和量的要求不尽相同。 一、提取生物大分子的基本思路 1．基本思路：选用一定的_______方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。（物理或化学） 2．提取DNA 的方法

(1)概念：利用DNA 与RNA 、______和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA ，去除其他成分。（蛋白质）

(2)原理：①分离：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的___溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的____就能使DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（NaCl 盐浓度 ） ②提纯：a ．DNA 不溶于__________，但是某些蛋白质则可溶于其中。(酒精溶液) b ．蛋白酶能水解蛋白质，但是对_______没有影响。(DNA) c ．大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温而发生变性，而DNA 在_____ 以上才会变性。(80 ℃) d ．洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA 没有影响。 利用以上原理可以将DNA 与蛋白质进一步分离。

③鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 被________染成蓝色。(二苯胺)

思考：为什么选用鸡血作实验材料？用哺乳动物的血作实验材料可以吗？

【提示】 鸡血经济且易制得，鸡血红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量DNA 。哺乳动物的红细胞没有细胞核，DNA 含量较低，因而不宜作实验材料。 二、操作提示

1．以血液为实验材料时，每100 mL 血液中需要加入3 g____________，防止血液凝固。(柠檬酸钠) 2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用______________时,动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成絮状沉淀。(玻璃棒搅拌) 3．二苯胺试剂要___________。(现配现用) 【解读】 提取DNA 的方法 1．DNA 粗提取的原理

分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质；在

NaCl 为0.14 mol/L 时，DNA 析出，过滤可除去溶解的部分蛋白质。 2．实验操作过程

(1)材料的选择①首先选择含有DNA 的生物材料。 ②选用DNA 含量相对较高的生物组织，成功率较大。

(2)材料的制备(以动物鸡血材料为例)

(3)方法步骤 （见右）

特别提醒

进一步提取DNA 时，可以用冷却的体积分数为95%的酒精溶液，

它主要有三个优点： ①抑制核酸水解酶的活性，防止DNA 降解；②降低分子运动，易于形成沉淀析出；③低温可以增加DNA 分子的柔韧性，减少断裂。 ①沿着同一方向快速搅拌，加速血细胞破裂，释放DNA 。

②搅拌含有悬浮物的溶液时，沿着同一方向缓慢搅拌，不能直插烧杯底部，防止打碎DNA 分子。 ③沿着同一方向缓慢搅拌并轻轻旋转，以利于絮状物缠绕在玻璃棒上。

(3)第一次用到蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，提取核DNA ；第二次用到蒸馏水的目的是稀释NaCl 溶液，使DNA 析出。 DNA 的鉴定方法

实验现象不明显的原因

(1)材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水用量不够。 (2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA 被破坏。

(3)析出含DNA 黏稠物时，蒸馏水沿着烧杯壁加入，可能一次加入太快。 (4)实验中多次使用玻璃棒搅拌，操作不当也会影响实验结果。 1.关于DNA 在NaCl 溶液中的溶解度，下面叙述中正确的时（ D ）

A.随着NaCl 溶液浓度的增大，DNA 在NaCl 溶液中的溶解度也增大

B.随着NaCl 溶液浓度的减少，DNA 在NaCl 溶液中的溶解度也减少

C.DNA 在NaCl 溶液中的溶解度与NaCl 溶液的浓度无关

D.当NaCl 溶液的浓度为0.14mol/l 时，DNA 的溶解度最低

2. 下列关于DNA 粗提取与鉴定的说法正确的是

A ．氯化钠的浓度越低，对DNA 的溶解度越大

B ．人血也可代替鸡血进行实验

C ．柠檬酸钠的主要作用是加速血细胞破裂

D ．DNA 不能溶于酒精

1．原理：DNA ＋二苯胺――→沸水浴5 min 蓝色 2．步骤：

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3. 在破碎鸡血细胞时，要先加入20ml 的蒸馏水，其作用是

A.DNA 溶解于水 B ． 血细胞破裂，DNA 释放 C ．稀释血液，防止凝固 D ． 有利于搅拌 4. 在DNA 的粗提取过程中，为了提取鸡血细胞中的核物质，需向鸡血细胞液中注入适量的液体，既使条件很不充分的条件下，所注液体也不能用

A ．未灭菌处理的但无污染的池水

B ．未长期静置的自来水

C ．灭菌后的蒸馏水

D ．灭菌后的生理盐水

5. 在DNA 粗提取实验中，向在溶解DNA 的NaCl 溶液中，不断加入蒸馏水的目的是

A ．有利于溶解DNA

B ．有利于溶解杂质

C ．减少DNA 的溶解度

D ．减少杂质的溶解度 6. 下列关于DNA 粗提取与鉴定的说法正确的是

A ．氯化钠的浓度越低，对DNA 的溶解度越大

B ．人体的血液不可代替鸡血进行该实验

C ．柠檬酸钠的主要作用是加速血细胞破裂

D ．利用DNA 易溶于酒精的特点可除去DNA 中的部分杂质

7. 下列操作中，对DNA 的提取量影响较小的是

A. 使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，发出DNA 等核物质

B. 搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动

C. 在析出DNA 粘稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多

D. 在用酒精沉淀DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却

8. 有关DNA 粗提取的描述中，正确的是

A. NaCl 溶液的浓度越大，DNA 的溶解度越大

B. DNA 易溶于酒精

C. 在破裂的鸡血细胞中加入蒸馏水，可使其破裂，放出DNA

D. 在破裂的鸡血细胞溶液中，加入2mol/l 的NaCl 溶液，可使DNA 大量析出

9. 若选择的实验材料为植物细胞，破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐，加入食盐的目的是 A. 利于DNA 的溶解 B. 分离DNA 和蛋白质 C. 溶解细胞膜 D. 溶解蛋白质

10. 蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA 分离出来，下列药品可达到上述同一目的的是 A. 蒸馏水 B. NaCl 溶液 C. NaOH 溶液 D. 盐酸 11. DNA 不溶于

A. NaCl 溶液

B. KCl 溶液

C. C 2H 5OH 溶液

D. MgCl 溶液 12. 提取含杂质较少的DNA 所用的溶液是

A. NaCl 溶液

B. 冷却的酒精体积分数为90％的溶液

C. 加热的酒精体积分数为90％的溶液

D. 冷却的酒精体积分数为90％的溶液 13. 如果在除去杂质时选择方案三，为什么要将滤液放在60－75℃的恒温水浴箱中保温10－15min A. 使DNA 变性 B. 使蛋白质变性 C. 使DNA 和蛋白质变性 D. 分解蛋白质

14. 在研究DNA 的基因样本前，采集来的血样需用蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。请问：用蛋白质水解酶处理血样的目的

A. 除去血浆中的蛋白质

B. 除去染色体上的蛋白质

C. 除去血细胞表面的蛋白质

D. 除去血细胞中的所有蛋白质，使DNA 释放，便于进一步提纯 15．本实验中有三次过滤：（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液（2）过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl 溶液 （3）过滤溶解有DNA 的2mol/LNaCl 溶液以上三次过滤分别为了获得

A ．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA 的滤液

B ．含核物质滤液、滤液中DNA 粘稠物、含DNA 的滤液

C ．含核物质的滤液、滤液中DNA 粘稠物、纱布上的DNA

D ．含较纯DNA 滤液、纱布上的粘稠物、含DNA 滤液

【迁移应用】

1. DNA 在NaCl 溶液中溶解度有二重性，随着NaCl 溶液的变化而变化。 （1）请在下列NaCl 溶液中选出溶解度能使DNA 析出最彻底的一种（ ）和溶解度最高的一种（ ）

A. 0.14mol/l

B. 2mol/l

C. 0.15mol/l

D. 0.3mol/l

（2）DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以____________，可以推测溶于酒精中的物质可能有____________。

（3）利用DNA 与_____变蓝色的特性，将该物质作为鉴定______的试剂。其实验过程要点是向放有_____的试管中加热4ml 的____。混合均匀后，将试管置于___5min ，待试管______，观察试管中溶液颜色的变化，这个实验也说明DNA 耐___温。

2.在“DNA 的粗提取与鉴定”的实验中，将提取获得的含有DNA 的粘稠物（还含有较多杂质）分别处理如下：

（1）放入0.14mol/l 的NaCl 溶液，搅拌后过滤，得滤液A 和粘稠物a （2）放入2mol/l 的NaCl 溶液，搅拌后过滤，得滤液B 和粘稠物b

（3）放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液C 和粘稠物c

以上过程获得的滤液和粘稠物中因含DNA 少而可以放弃的是 。 3. 回答下列关于DNA 粗提取实验的问题：

（1）实验中，在鸡血细胞液中加入20ml 蒸馏水的目的是__________，当过滤取得滤液后，再向溶

液中加入2mol/l 的NaCl 溶液的目的是__________。接着向NaCl 溶液中加蒸馏水的目的是__________。

（2）DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是变化的，当丝状物不再增加时，NaCl 溶液的浓度相当于__________。

4．关于DNA 粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：

（1）鸡血细胞中红细胞 ，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞数目较多，可以提供丰富的 。

（2）实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是 。

（3）生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是 ，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中 ，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为 。 （4）若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分离。 5.某生物兴趣小组开展DNA 粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：

材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份．每份l0 g 。剪碎后分成两组，一组置于20℃、另一组置于–20℃条件下保存24 h 。

DNA 粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入l5 mL 研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。

第二步：先向6只小烧杯中分别注入10mL 滤液，再加入20 mL 体积分数为95％的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。

第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol ／L NaCl 溶液溶解上述絮状物。

DNA 检测：在上述试管中各加入4 mL 二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min ，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。 分析上述实验过程，回答下列问题：

(1)该探究性实验课题名称是 。 (2)第二步中”缓缓地”搅拌，这是为了减少 。 (3)根据实验结果，得出结论并分析。 ①结论1：与20℃相比，相同实验材料在-20℃条件下保存，DNA 的提取量较多。 结论2： 。 ②针对结论1．请提出合理的解释： 。 (4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA 均不相溶，且对DNA 影响极小。为了进一步提高DNA 纯度，依据氯仿的特性．在DNA 粗提取第三步的基础上继续操作的步是： 。然后用体积分数为95％的冷酒精溶液使DNA 析出。 6．如图为“DNA 的粗提取与鉴定”实验的相关操作。

(1)图中实验材料A 可以是________等，研磨前加入的B 应该是_____________________ 。 (2)通过上述所示步骤得到滤液C 后，再向滤液中加入2 mol/L 的NaCl 溶液的目的是____________________________________________________________________， 再过滤得到滤液D ，向滤液D 中加入蒸馏水的目的是______________________ 。 (3)在“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA 丝状物分别放入体积为2 mL 的4

。

(4)DNA