K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
实验 抗菌药物敏感性试验 PPT课件
（三）结果
• 2.结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参 照标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、 耐药（R）报告。 • 3.质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在预期 范围内。如果超出该范围，应视为失控而不 发报告，须及时查找原因，予以纠正。
影响结果的因素
• • • • 培养基 抗菌药物纸片 菌量 操作质量
•
•
药敏纸片的选择
待测菌 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 大肠埃希菌 ATCC25922 药物
AMK、 PEN、OXA、 VAN、GEN 、CIP
AMK、FTX、GEN、PIP、 CIP、IPM AMK、FTX、GEN、PIP、 CIP、IPM
铜绿假单胞菌 ATCC27853
（三）结果
• 1.结果判读： 平板置黑色无反光背景上，测量抑菌环的 直径。 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长 为限。 有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环； 磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些 都不作为抑菌环的边缘。
步骤和方法
• （一）原理 • （二）方法 • （三）结果
（一）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接 种检测菌的琼脂平板上。在纸片周围区 域扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内检测菌的生长被抑制， 形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映 检测菌对测定药物的敏感程度，并与该 药对检测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负 相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
培养基
• pH：7.2～7.4最适宜，碱性扩大氨基糖 苷类药物的抑菌环，酸性扩大四环素类 药物的抑菌环。 • 琼脂含量：影响抑菌环的大小。 • 厚度：影响抑菌环的大小，以4mm为宜。
抗菌药物纸片
• 纸片含药量：与纸片的重量、吸水性、 直径等有关，影响抑菌环的大小，批量 制备。 • 纸片的保存：须在有干燥剂的容器内低 温(-10℃以下)保存。只拿出少量放4℃ 备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取 出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可 打开。
实验四 抗生素敏感实验
（3）大肠杆菌在SS琼脂平板上因分解乳糖，形成红色的、圆形、凸起、 边缘整齐的菌落，多为光滑型菌落。肠道致病菌（沙门菌属、志贺菌属） 在SS琼脂平板上由于不分解乳糖则形成无色透明、中等大小的菌落。 （4）大肠杆菌在麦康凯琼脂平板上形成红色、中等大小的菌落。肠道致病 菌（沙门菌属、志贺菌属）。在麦康凯琼脂平板上由于不分解乳糖则形成 无色透明、中等大小、光滑型的菌落。
含药纸片
抑菌圈
三、材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌18-24小时琼脂 斜面培养物。 2、培养基：普通琼脂平板 3、分别含各种抗生素（青霉素、链霉素、庆大 霉素、红霉素等）的圆形滤纸片（直径 0.6cm）。小镊子等。
四、方法
1、取琼脂平板两只，每只平板表面分四等份， 于皿底注明待检抗生素名称。 2、于两只平板用棉拭子或接种环分别密涂大肠 杆菌及葡萄球菌于琼脂平板表面中央，注明药名、班 级、姓名、日期等。 4、置于37℃孵育24小时，观察各种药物滤纸 片周围的抑菌环、测量其直径。
五、结果判定
抑菌程度的判定是依照滤纸片周围细菌的 生长与抑菌圈直径大小判定 ①不敏感—纸片周围细菌生长，无抑菌环。 ②轻度敏感--纸片周围细菌不生长，抑菌环小 于10mm。 ③中度敏感--纸片周围细菌不生长，抑菌环在 10-15mm。 ④高度敏感--纸片周围细菌不生长，抑菌环在 15mm以上。
实验七
抗生素敏感实验
一、实验目的和要求
掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作方
法等、结果判断、意义及质量控制； 了解大肠杆菌、葡萄球菌对几种抗生素的敏 感性。
二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼
脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶 解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯 度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长 被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关，即抑 菌圈愈大，MIC愈小。
K-B纸片法
第二部分
实验方法
实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养 基琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种丌同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
药敏纸片制备
实验常觃抗菌药物选择： 在标准中分成A、B、C 、U四组, A组所列的抗生素 为常觃首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素, 尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使 用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源丌同时， 如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶 唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多 部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素 过敏、耐受或无反应。
药敏纸片制备
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些丌常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，丌作为尿道 外分离菌的常觃药敏试验。
药敏纸片制备
以大肠杆菌为例 ①纸片制备 ：选择优质滤纸，用打孔器制成直径 6mm圆形滤纸片。经120℃2h灭菌后备用 ②药物稀释 每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液 需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的丌同浓度配制 药物原液。 药液浓度见下表。 ③课埻的实验中仅使用了青霉素 链霉素 氯霉素
结果判定
第四部分
实验优缺点
K—B纸片法优点
药敏试 验具有重复性较好 、操作简便 、试验成本相 对较低 、结果直观 、容易判读、便于基层开展的优 点。
抗菌药物敏感性试验药敏试验
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度
相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床
报告方式
常规报告 敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位达 到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组 织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能 低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在 药物被生理浓集的部位发挥临床效力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组 织或血液内达到的浓度所抑制
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 肠杆菌科 唑啉（敏感）
所有喹诺酮类敏感 所有头孢菌素敏感
万古霉素 氨苄西林
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的 菌落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中 （如胰酶消化大豆胨肉汤）
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法 生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基 上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
kb纸片法药敏实验名词解释
kb纸片法药敏实验名词解释
KB纸片法是一种常见的药敏实验方法，用于测试细菌对抗生素的敏感性。
这项实验通常用于临床医学和微生物学领域。
下面我将从多个角度来解释这些名词。
首先，KB纸片法是指Kirby-Bauer纸片法，是一种半定量的抗生素敏感试验方法。
在这个方法中，细菌培养物被均匀涂布在琼脂平板上，然后在表面放置含有不同抗生素的纸片。
细菌在培养基上生长形成菌落，如果细菌对某种抗生素敏感，它们就不会在靠近含有该抗生素的纸片的区域生长，形成所谓的抑制圈。
通过测量这些抑制圈的直径，可以判断细菌对抗生素的敏感性。
其次，药敏实验是指药物敏感性试验，用于评估细菌或其他微生物对抗生素或其他药物的敏感性。
这项实验对于选择治疗感染性疾病的最佳药物非常重要，因为它可以帮助医生确定哪种药物对特定的病原体最有效。
综上所述，KB纸片法药敏实验是一种通过测量细菌对抗生素的敏感性来评估药物治疗效果的方法，它在临床医学和微生物学领域有着广泛的应用。
希望这些解释能够帮助你更好地理解这些名词。
K-B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析
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药杂 志 ， ０ ，１ ８１． ２ ２１： －９ ０ １
［３ １】青俐 ． 车前草穴位 贴敷 治疗产后尿潴 留叨． 中医２０， （ ： － ． 四川 ０１９６２ ２ １ ）２ ２
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抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
作业指导书-K-B纸片琼脂扩散法药敏试验操作
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；
2、配制MH（A）培养基，121℃高压灭菌15min，取出后在净化工作台中倒入无菌平皿中，每个平皿倒入20ml左右，使培养基厚度约4mm左右；晾干后备用；
3、在净化工作台中进行试验操作，用移液枪取校正好的菌液100μl注入已制备好的MH培养基上，用玻璃涂棒涂抹均匀；
检查要点
使用材料
1）取定性滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，经121℃高压灭菌30min后，放在60℃的烘箱中烘干备用；
2）试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；药液配制方法参照CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010版）中规定的配制；药液配制在净化工作台中进行；
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般பைடு நூலகம்境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
3.纸片在使用前1～2h从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中，纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。
1.打孔机、手提式高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥箱、电子天平；
2.无菌水、磷酸缓冲盐溶液等溶剂
3.新华定性滤纸
材料处理
1.将材料2及圆纸片放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，灭菌121℃、30分钟；
K-B纸片扩散法药敏试验技术要点
2.3菌液的接种量细菌接种量是药敏试验结果产生较大差的原因之一，余修中[3]在K-B纸片扩散法药敏试验菌液量的规范研究中提出固定接种0.35ml菌液量的规范。到目前为止，NCCLS推荐使用的是采用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的接种菌液。然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次将平板转动约60度，最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘，对接种菌量未做客观要求。鉴于上述情况，建议在进行药敏试验用棉拭子涂布时，尽量保证选用同一品牌、大小相同的棉拭子，以减少误差，确保药敏试验的准确可靠。
3培养基
3.1培养基的选择药敏试验中，为保证结果重复性及抑菌环的大小清晰，应选择对抗生素及磺胺药物无拮抗剂的培养基。水解酪蛋白（Mueller-Hinton,MH）培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，PH为7.2-7.4，临床实验室常规敏感试验，除了检测容易生长的在M-H培养基的需氧、兼性厌氧菌外，尚有许多不能在M-H培养基上生长或生长不良的菌株。如链球菌属、流感嗜血杆菌及淋病奈瑟菌。培养基内必须补充特殊的营养成份。流感嗜血杆菌应选用嗜血杆菌试验培养基（HTM）[4]；肺炎链球菌和其他链球菌所用培养基是在M-H琼脂中加5%脱纤维羊血。
[3]余修中，K-B法药敏试验中菌液量的规范[J],四川省卫生管理干部学院学报，2002.9（21）：177.178.
[4]王传新、王国礼，现代检验医学技术及质量控制[M]，济南，山东科学技术出版社，204:171.
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法抗生素敏感试验标准操作程序
SOP_15-25 纸片扩散法（K-B法）抗生素敏感试验标准操作程序【目的】用于分离菌的抗生素敏感试验。
【适用范围】WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【试验用材料】1.培养基Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。
琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
2.药物纸片抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。
采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。
药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。
用以下两个指标判定纸片的质量：2.1片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。
测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。
35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。
2.2准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。
纸片的合理保存十分重要。
药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。
K_B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析
隐匿性肾炎的表现为单纯性血尿，类似于中医尿血，多因湿热下注所致。
金顺英等[14]将35例单纯血尿患者随机分组，治疗组每日服鲜车前草汁，对照组注意休息，预防感染，对症治疗。
8周后治疗组总有效率达85%以上，而对照组尿常规改变不明显，仅38.7%有效，二者有显著差异。
表明用此法治疗肾性血尿作用明显，且取材服用简便，久服未见毒副反应。
2.2.5 治疗阴道炎陈晓飞等[15]取新鲜车前草煎汁，对48例阴道炎患者进行浸泡治疗，结果29例外阴湿疹患者全部痊愈，l3例非特异性阴道炎及6例老年性阴道炎患者，治疗后症状明显减轻。
2.2.6 治疗急性乳腺炎急性乳腺炎为初产妇的常见病，分为未化脓型和化脓型两种。
陈福仁等[9]将捣烂的车前草捏成鼻孔大小的圆锥状，塞入患者鼻腔，15h/次，最多经3次治疗后，31例未化脓型者均可痊愈，但该法对化脓性乳腺炎无效。
王寿昌等[16]在10年期间对21例患者使用拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎，效果亦较好。
2.2.7 其他研究发现，车前草还可用来治疗运动性血红蛋白尿[17]、角膜翳[18]、痢疾[19]” 以及小儿迁延性肺炎、尿血、胃肠性感冒等儿科病症[20]，均取得了满意的结果。
3 小 结车前草资源丰富，用途广泛，且毒副作用小，随着现代技术的不断发展以及各学科间的不断完善，车前草会给人类带来更大的经济和社会效益。
参考文献[1] (魏)吴莆.神农本草经[J].北京:人民卫生出版社,1963:18.[2] 季大洪.中药车前研究与应用概况[J].药学实践杂志,2001,19(6):361-362.[3] 董杰明,袁昌鲁.车前草及芒苞车前草化学成分及其形态学研究[J].辽宁中医学院学报,2002,4(3):229-230.[4] 吴斐华,王奇志,梁敬钰,等.车前化学成分和保肝活性[J].中国天然药物,2006,4(6):435-439.[5] Toda S, Miylase T, Arichi H, et al. Natural antioxidants: 1l.Antiox-idative components isolated from seeds of plantago asiatica LINNE [J].Chem Pharm Bull,1985,33(3):1270.[6] Oshio H, Onouye H. Two new ifidoid ghucocides of plantago asiaticaLINNE[J].Plants Med ,1982,44(4):204.[7] Rava H, Nishibe S, Sasahara M, et al. Phenolic compounds fromplantago asiatica[J].Phytachem,1990,29(11):3627.[8] 回瑞华,侯冬岩,李铁纯,等. 中国车前草挥发性化学成分分析[J].分析实验室,2004,23(8).[9] 陈福仁,李小黎.新鲜车前草治疗急性乳腺炎31例疗效观察[J].浙江中西医结合杂志,1997,7(1):60.[10] 王寿昌,孙克勤.拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎[J].安徽中医临床杂志,1998,10(1):61.[11] 刘智成,刘正生,罗德云.车前草软膏治疗褥疮患者的护理[J].镇江医学院学报,1999,9(1):157.[12] 陈剑屏,袁启霞.车前草汤治疗慢性活动肝炎232例[J].上海中医药杂志,2002,11:18-19.[13] 青俐.车前草穴位贴敷治疗产后尿潴留[J].四川中医,2001,19(6):22-22.[14] 金顺英,张兴家,张世英,等.车前草治疗单纯血尿[J].长春中医学院学报,1997,13(6):16.[15] 陈晓飞,罗勤芬.车前草治疗阴道炎48例[J].中国实验方剂杂志,1998,4(2):40.[16] 王寿昌,孙克勤.拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎[J].安徽中医临床杂志,1998,10(1):61.[17] 孙神虎.我国是世界上最早利用车前草治疗行军尿的国家[J].甘肃中医,2002,15(3):75.[18] 周斌.车前草薰敷治疗角膜翳[J].中国民间疗法,1998.6:26-26.[19] 顾启梓.车前草治痢疾[J].中国民间疗法,1998,2:55-55.[20] 徐鑫.车前草儿科应用举隅[J].陕西中医,1998,19(1):376-377.K-B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析王亚霞 苏振杰 任凤秋【摘要】细菌药物敏感试验的结果是临床合理用药的重要依据，确保其结果的准确性，必须了解试验中培养基种类及质量、试验用药的纯度和菌液的浓度、药物的含量及孵育时间等诸多因素的影响。
纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析
纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。
在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。
该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。
1 实验材料抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。
纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。
日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。
培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4 mm)。
使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。
药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。
①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。
②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。
2 实验方法2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。
盖上表面皿盖，置室温放置3～5min，使平皿表面稍干。
2.2 贴放药物纸片：用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片平整地贴于平板表面，稍加按压使纸片贴紧。
注意纸片分布均匀，各纸片中心相距24mm以上，纸片距平板内缘应大于15mm。
纸片贴牢后切勿移动，否则会影响抑菌圈的形状。
2.3培养：贴好纸片后，须于15min内将平板置于35℃培养箱中，孵育至规定时间(一般为18～24h)。
实验三：药敏资料讲解
(80单位）
金葡菌
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
结果
细菌生长
-- - -- ++
++
青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照--
结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度
为该药对检测菌的MIC
影响因素？临床意义？
定量的测试菌的制备
1、将金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡 萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度 至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)； 或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中 研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。
2、将调好浊度的菌液用无菌肉汤稀释10倍， 即可使用。
思考题： 影响因素？ 1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？ 2、纸片质量 3、接种细菌的菌量 4、孵育的温度和时间 5、操作因素
稀释法
微量稀释法 常量稀释法（试管稀释法）
常量稀释法（试管稀释法）
1、实验目的： 用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓
度（MIC） 2、实验原理：
将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释， 再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养 后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此 菌的MIC。
3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌 的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重 做。
结果观察： 1、结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的标
准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报 告。 例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药 量30微克，抑菌圈≤14mm为耐药，15-16mm为中介， ≥17mm为敏感。 2、质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围 内，如果超出该范围，应为失控，而不发报告，应及时 查找原因，予以纠正。 例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药 量30微克，金黄色葡萄球菌ATCC标准株的抑菌圈应在 20-26mm之间。
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平板霉素类似物生物活性评价
平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：
1.原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂
仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台
试剂：样品溶液、培养基
3.菌液的配置
从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板
在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝
固。
5.粘贴药敏纸片
用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
分别吸取样品溶液5μL点在滤纸片上，点样后放置30min，待其扩散均匀相对干燥后，倒置于37℃培养箱中恒温培养16-20h。
培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用。
6.结果判定
培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。
抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，有些抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。
按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。