抗生素效价测定操作规程

1.主题内容和适用范围

本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。

本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。

2.引用标准

《中国药典》2015年版四部。

3.术语

抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。

4.操作技术（仪器与用具）

4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注

意抗生素的污染。

4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液

中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。

4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。

4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g.

用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用.

4.5钢管放置器

4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃

4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000

苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用.

4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水

洗、PW冲3次

4.9称量瓶:具塞,重量在10g以下.水冲洗、淋干,置清洁液浸泡2小时以上,水洗、PW冲

3次,置洁净的大平皿中.120℃干热3h,待冷到70-60℃时,取出置干燥器中备用.

4.10毛细滴管: 清洁液浸泡, 水洗、PW冲3次.120℃干燥3h

4.11天平:分析天平,感量0.1mg

4.12抑菌圈测量仪(多功能微生物自动测量分析仪)

4.13超净工作台

5.菌悬液制备

取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水1~2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，摊布均匀，在35~37℃培养7天。取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死，待冷后置4℃冷藏箱贮藏。此菌液为浓菌液。

日常试验用菌液取上述浓菌液，用灭菌水1∶3稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。

6.培养基

称取培养基干粉g溶于ml水中，制备好的培养基，在121℃蒸汽灭菌30min。制成的培养基不应有沉淀，临用前应置于水浴中或微波炉中融化，避免直火加热。

7.缓冲溶液制备

磷酸盐缓冲溶液（PH7.8）称取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml,滤过，在121℃蒸汽灭菌30min。

8.灭菌水制备

取纯化水500ml，在121℃蒸汽灭菌30min。

9.样品及供试品制备（标准品的取用量不得少于20mg）

9.1称样量计算

V ×C

W=-----------------

P

式中W 为称取标准品或供试品的重量（mg）

V 为溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积（ml）

C 为标准品或供试品浓溶液的浓度(u/ml或μg/ml)

P 为标准品的纯度或供试品的估计效价(u/mgμg/mg)

9.2稀释(每步稀释，量取量不得少于2ml，稀释步骤一般不超过3步)

标准品及样品（以红霉素为例）

乙醇+灭菌水

mg (u/mg) ---------------------→ ml (u/ml)

PH7.8磷酸盐缓冲溶液

ml (u/ml) ---------------------→ ml (u/ml)

高剂量

PH7.8磷酸盐缓冲溶液

ml (u/ml) ---------------------→ ml (u/ml)

低剂量

PH7.8磷酸盐缓冲溶液

ml (u/ml) ---------------------→ ml (u/ml)

10.双碟制备

10.1在半无菌室内进行，应注意微生物及抗生素的污染。

10.2底层用灭菌大口20ml吸管或其他灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml注入双

碟内，使底层摊布均匀，盖上陶瓦盖，待凝固。

10.3菌层取出实验用菌悬液，按预试好的加菌量，用灭菌吸管吸取菌悬液适量，加入

已融化并保温在水浴中的培养基（65℃以下）内，摇匀，作为菌层培养基。用灭菌大口5ml吸管或其他适宜分装器，吸取菌层培养基5ml，加于底层培养基上，使其均匀摊布，放置20~30分钟，待凝固。

10.4放置钢管用小眼科镊子夹持钢管，轻轻地放置在培养基上。相应剂量的钢管，对

角放置。钢管放妥后，应使双碟静置5~10分钟，钢管在琼脂上沉稳后，再开始滴加抗生素溶液.

10.5滴加抗生素溶液

10.5.1每批样品不少于6个双碟，用灭菌的毛细滴管滴加，在滴加之前须用溶液洗2~3

次。

10.5.2滴加标准品及供试品溶液顺序：SH-TH-TL-SL

滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液的间隔不可过长，否则因钢管内溶液的扩散时间不同会影响测定结果。加液要满，但不能溢出，同一双碟内4个钢管的加液量要一致。

10.5.3每种溶液要各用一支毛细滴管，每1份滴加的溶液为同一单位，但双碟数不超过

5个，如果一份溶液滴加双碟数目多，可分次滴加。

10.5.4加完抗生素后，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3

层，置入隔水式培养箱内培养，设置温度为35℃～37℃。

10.6培养14~16h后取出置多功能微生物自动测量分析仪检测。