基因工程一轮复习(上课用)

变性
循环
目的基因 的扩增呈 指数形式 扩增（2n）
退火
延伸
利用PCR技术扩增目的基因
关于PCR技术
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_复__制____
③前提条件：已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列_、一__对__引__物__、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、_D_N_A_聚__合__酶___。
②cDNA文库的构建方法
mRNA 逆转录酶
单链DNA DNA聚合酶
双链DNA（cDNA）
用DNA连接酶 与载体连接
重组体
多个 克隆
含重组体的
导入
受体细胞
受体细胞
增殖（转基因细胞）筛选
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA导入到
适当的宿主细胞中，通过细胞增殖构成各个DNA片段的克 隆，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
要切两个切口，产生四个黏性末端。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种 限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就可以合成重组的 DNA分子了。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA片段怎么连接起来？
DNA双链分子上相邻3’羟基和5’磷酸基团共价 结合，形成3’-5’磷酸二酯键，使原来断开的缺口 重新连接起来。
基因工程专题复习
2010北京高考考试说明要求
基因工程的基本原理与技术：
基因工程
工具酶的主要类型、特性及作用 操作步骤
Ⅰ
应用与前景
知识结构
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工
基因组文库：包含该 生物的所有基因。
一般针对原核生物而建立
cDNA文库：包含该 生物的部分基因。
一般针对真核生物部分 基因的编码区而建立
DNA合成仪
* 人工合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
利用PCR技术扩增目的基因：P7课外读
聚合酶链式反应（PCR），在生物体外复制 特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的 目的基因。
基因工程的基本操作步骤
5、目的基因的表达
（1） 分子 水平 检测
检测转基因生物基的因D探N针A是否插入目的基因 （DN—A—探DNA分子杂交技术
检测目的基因是针否）转与录目出了mRNA： 的交基，—因检—杂测分子杂交技术
检测目的基因是有否无翻杂译交成蛋白质： ——提带取出蛋现白质、抗原-抗体杂交
无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物
• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫特性)
提取
与运载体DNA拼接
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因)
导入
棉花植株(有抗虫特性)
1 获得人的胰岛素基因 ——目的基因的获取①
2 将目的基因转移入大肠杆菌
（1）能否将人的胰岛素基因进入到大肠杆菌中？ ——形成重组DNA分子②
（2）怎样才能让大肠杆菌含有重组质粒？ ——将重组DNA分子导入受体细胞③
（3）如何判定人的胰岛素基因导入是否成功了？ ——筛选含有目的基因的受体细胞④
3 大肠杆菌能合成人的胰岛素 ——目的基因的表达⑤
基因工程流程图
基因工程的基本操作步骤
1、获取目的基因
• 从基因文库中获取目的基因（限制酶切取）
目的基因 序列未知
利用DNA合成仪
化学方法合成 反转录法
目的基因 • 人工合成
上以合以成t你括R具mN能几AR有说个为N一出步A运为定基骤载模氨因吗工板基控？具制如蛋何核条照白形内链碱质象以为基的的D模互合 记N板补成住A，配的，它按对一包？
酸顺序的蛋白质的 原则合成mRNA
过程。
的过程。
思考：
5、基因工程是什么？其基本原理是？
6、基因工程的基本工具有？这些工具 分别具有什么作用和特点（特性）？
酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1）将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法 ——主要侵染双子叶植物
基因枪法
花粉管通道法
转化：
目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且 在受体细胞内维持_稳__定__和_表__达__的 过程
基因枪法
• 金—粉或—铅常粉 用于 • 高单压氦子气叶——植30物0~600米/秒
GAATTC CTTAAG
限制性内切酶
AATTC
G
G
CTTAA
目的基因
AATTC G
载体
限制性内切酶
G CTTAA
思考：形成的重组DNA分T4 D子NA中连接，酶由2个DNA片段之 间连接形成的产物有哪些种15ºC类？
重组运载体
运载体自连
目的基因自连
基一因定表体可达外以载重表体组达的形目构成的建D基N—因A基？分因子工是程否的核就心
4、真、原核细胞的基因在进行表达时 有何异同？
你能用简短的语言表述一下以下名词之间 的关系吗?
基因a
基因 DNA 染色体
基因b
基因f
基因c 基因d
基因e
● 基因的遗传效应 是指复制、转录、翻译、调控、突变、重组等功能。
原核细胞的基因结构
不能转录 非编码区
调控
上游
与RNA聚合酶 结合位点
RNA聚合酶 识别转录位点 催化DNA转录为RNA
基因工程的基本操作步骤
2、形成重组DNA分子
质粒
目的基因所在 的DNA分子
同一种
限制性核酸内 切酶处理
DNA分子的体外重组：
指外源DNA分子在体 外的共价连接。
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得具相同黏性 末端的目的基因
催化这一反应是DNA 连接酶。
DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
GAATTC CTTAAG
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、在aD热N、A作变高用性温下（，9变0_℃氢_性_-键_9_5℃断裂），：形双成链D_N_单A__模链__板D_N_A___
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引
2、种类：数千种
3、作用：特异性 限制性内切酶及其缓冲液
识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸 序列，并且使每一条链中特定部位的两 个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
4、结果：形成黏性末端（有的也可形成平末端）
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
思考
• 要想获得某个特定性状的基因必须要 用限制酶切几个切口？可产生几个黏 性末端？
能转录 编码区
调控
不能转录 非编码区
转录 翻译 蛋白质——性状
mRNA
下游
实例：鸡卵清蛋白mRNA与DNA 杂交实验
鸡卵清蛋白基因的大小和结构如下：
7 500 bp
A L
BC D E
F
G
12 3 4
56
12 3 4 12 3 4
7
① A、B、C、D、E、F、G 的序列不能转录，约占 75.2%(5641bp) ② L、1、2、3、4、5、6、7 的序列能够转录，约占 24.8%(1859bp)
DNA分子杂交技术
抗药性筛选法：
• 如:利用重组 质粒上的抗性 基因(标记基 因）进行筛选
营养缺陷性筛选法：
• 载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生 物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养 物质。两者构成营养缺陷。
• 在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存 活的是导入成功的受体细胞。
真核细胞的基因结构
非编码区
与RNA聚合酶 1 结合位点
前体mRNA
成熟mRNA
肽链
编码区
234 转录 加工 翻译
非编码区
编码区下游
5
外显子
内含子
不间断、连续的
典型的原核细胞基因结构示意图
间隔、不连续的
典型的真核细胞基因结构示意图
遗传信息的表达（基因控制蛋白质的合成）， 包括转录和翻译。
2、翻译：在核糖体 1、转录：在细胞
目的：使目的基因在受体细胞中稳定
存在，并遗传给下一代，使目的基因 表达和发挥作用。
表达载体的组成： 目的基因、启动子 终止子、标记基因……
表达载体 不同
受体细胞不同；
目的基因导入受体细胞 方法不同
基因工程的基本操作步骤
3、将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗 传物质少
（2）方法： 如：以大肠杆菌作为受体细胞
用Ca2+处理受体细胞（增加细菌细胞壁的 通透性） 感受态细胞（处于一种能够
吸收周围环境中DNA分子的理想状态）
表达载体与感受态细胞混合 感受态 细胞吸收DNA分子
基因工程的基本操作步骤
4、筛选含有目的基因的受体细胞
7、以“抗虫棉的培育”或“胰岛素的 生产”为例，能否简述出基因工程的 基本操作步骤？
8、基因工程的应用及成功实例有？
基因工程的概念
基因工程又叫基因拼接技术或DNA重 组技术。该技术是在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”， 对生物的基因进行改造和重新组合，然后 导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基 因在受体细胞内表达，产生出人类所需要 的基因产物。
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
DNA连接酶 的作用示意图
DNA聚合酶 的作用示意图
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
三、载体——“分子运输车”
• 外源基因(如胰岛素基因)怎样才能导入受体 细胞(如大肠杆菌)？ 导入过程需要运输工具——载体。
理想载体具备四个条件： 1)具有对受体细胞的可转移性（没 有毒害），提高导入细胞的效率。 2)具有与特定受体细胞相适应的复 制位点或整合位点，使外源基因在 受体细胞中稳定遗传。 3)具有多种单一的核酸内切酶识别 切割位点，有利于外源基因的拼接 插入。 4)具有合适的选择标记（报告基 因），便于DNA重组分子的检测。
（2）个体水平检测：检测性状
一、植物基因工程硕果累累
转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及 改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
1.转基因抗虫植物
2.转基因抗病毒植物
3.其他转基因抗逆植物
Leabharlann Baidu
阅读课本P9~10并回答，到目前为止，基因 工程技术解决了哪些不同种生物之间的性
状重组问题?
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯
转鱼抗寒基 因的番茄
不会引起过敏的转基因大豆
4.利用转基因改良植物的品质
提高观赏价值
基因工程在农业上的应用
1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的
根据已知的氨基 酸序列合成DNA
目的基因 序列已知
聚合酶链式反应扩增（PCR） 目的基因
（1）基因文库的构建方法
①基因组文库的构建
供体细胞中的DNA
限制酶 切割
许多DNA片段
用DNA 连接酶 将DNA 片段 与载体 连接
重组DNA分子
导入
受体细胞
增殖
多个克隆
通过对受体菌的培养而储存基因
（1）基因文库的构建方法
• 穿过细胞——整合 • 核＋叶绿体＋线粒体
花粉管通道法
显微注射技术
2）将目的基因导入动物细胞 提纯基因表达载体 （重组DNA）
取卵（受精卵），并于 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
新性状动物
例：从转基因羊的羊奶中 提取出治疗心脏病的药 物 tPA。同样方法可获 得疫苗、生长激素等。
3）将目的基因导入微生物细胞
程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
思考：
1、什么是基因？其载体是什么？
2、遗传信息指的是？“遗传效应”指 的是？
3、不同生物的基因为什么能拼接？真、 原核细胞的基因结构是怎样的？
基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程
切 →接 →导 →检
实质
基因重组
结果
获得人类需要的基因产物
一、限制性核酸内切酶—— “分子手术刀”
作用——与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1、来源：微生物
物与bD、NA模低板温结退合，火形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从
引c物、的中5′温端延→3伸′端延伸，合成与模板互补
的__D_N_A_链___。
检测题（多选）下列获取目的基因的方法 中需要模板链是（ B、C ） A.从基因文库中获取目的基因 B.利用PCR技术扩增目的基因 C.反转录法 D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成