snp技术

• SNP的分型
例如:某些人染色体上某个位置的碱基是A,而另一些 人染色体的相同位置上的碱基则是G。同一位置 上的每个碱基类型叫做一个等位位点。除性染色 体外,每个人体内的染色体都有两份。一个人所拥 有的一对等位位点的类型被称作基因型 ( genotype ) 。对上述SNP 位点而言,一个人的基 因型有3 种可能性,分别是AA、AG或GG。基因型 这一名称既可以指个体的某个SNP的等位位点,也 可以指基因组中很多SNPs的等位位点。
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突 变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体 位置。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。
电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。
DNA测序法
• 直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测 序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检 出率可达100%。
特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分 型所需要的重要参数。
基因芯片技术( Genechips)
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。
如果样本数增加,SNP会继续增加 300-600bp即会出现一个SNP SNP是继微卫星之后的第三代遗传标记。
• 与限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 和简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）等常用分子标记相比， SNP具有分布密度高、遗传稳定、与表型 性状相关性强、检测简便、易于实现自动
用Taqman进行snp分析
测序技术的发展
• 双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法) – 1970s 同位素标记，手工 – 1980s 荧光标记，自动 – 1990s 毛细管电泳
• 合成测序法（第二代测序） – 焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454） – 合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） – 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD）
PCR-RFLP方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片 断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位 点。
特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该 限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的 方法之一.
• 单分子测序技术（第三代测序） – Helicos – Pacific Biosciences – Oxford Nanopore
Ion Torrent 技术 （半导体测序，非光学）
32
表1.1 目前使用最广泛的三大第二代测序平台 测序能力统计信息（2010年年初数据）
厂商
Roche
Illumina
MassARRAY技术原理:
• MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP 位点设计一段探针，在反应体系中以 ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处 延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不 同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有 不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分 子量差异，从而实现SNP分型的目的。
ABI
技术
454
Solexa GA
SOLiD
测序仪
GS20 FLX Ti
I
II
IIx
1
2
3
序列数目（百万）
0.5
0.5 1.25
28
百度文库
100 250
40
115 320
单末端测序（Single-end）
读长（bp）
100 200 400
35
50
100
25
35
50
运行时间（天）
0.25 0.3
0.4
3
3
5
C-G、G-T
• 依据排列组合原理一共可以有6种替换情况
• A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T
• 但事实上,转换的发生频率占多数,而且是CT 转换为主
• 其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱 氨基形成T
• SNP发生频率 在动物基因组中分布广泛
如果随即抽取两个人的基因组对比,大概1000 个碱基就会出现一个SNP
关于单体型haplotype
• 人类基因组中,相邻近的SNPs等位位点倾向于以 一个整体遗传给后代。
• 位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的 SNP 等位位点被称作单体型( haplotype) 。
• 如果一个单体型有N 个变异位点,理论上就可能有 n的4次方种可能的单体型。实际上,大多数染色体 区域只有少数几个常见的单体型(它们代表了一个 群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体 区域可以有很多SNP位点,但是只用少数几个标签 SNPs,就能够提供该区域内大多数的遗传多态模 式,这样将大大减少用于基因型与疾病关联分析中 的SNPs—基于板块理论。
变性高效液相色谱( DHPLC)
原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变 碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异 源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同 源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来, 从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰 形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的 碱基。
0.3
0.4
6
10
10
12
10
16
通量（Gb）
0.1
0.5
2
9
50
2
8
32
Solexa和SOLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端 差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。
ABI SOLiD包含两张芯片，这里的数据是一张芯片的量。 http://www.politigenomics.com
SNPs高通量的检测方法
另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通 量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用 的有:
1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等等 5 . Realtime-pcr法（taqman）
SNP 的特点
（3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标 记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。
（4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中 只有两种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个 “ + \- ”或“全\无”的方式，而无须象检测限制性
片 段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测 量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动 化。
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,ASPCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 SNP。
Snp技术
SNP概念
• SNP，single nucleotide polymorphism， 单核苷酸多态性。是指基因组水平上由单 个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性, 在群体中的发生频率不小于1 %。
• 包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失 等
• 转换是指同型碱基之间 G-A,T-C • 颠换是指发生在嘌呤与嘧啶之间A-T、A-C、
特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自 动 化 的 优 点 ， 对 未 知 SNPs 的 准 确 率 可 达 95% 以 上 。 但 DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差, 不 能检测出纯合突变。
MassARRAY
• SNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术 是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过 引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相 结合，实现基因分型检测。 • 基于MassARRAY® 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术 可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非 常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基因组研究发 现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的 情况。
特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的 突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂, 所 需设备贵重, 不利于普及应用。
MALDI-TOF
原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上 的化合物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火, 延伸反应, 突变部位配对的碱基与正常配对的碱基 不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基 的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。
化分析等诸多优点，被称为第三代分子标 记。
SNP 的特点
• 在遗传学分析中, SNP 作为一类遗传标记得以广泛 应用, 主要源于这几个特点: （1）密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计 为 1\1000 bp , 在整个基因组的分布达 3×106个, 遗传距离为 2～3cM , 密度比微卫星标记更高, 可以 在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标 记。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的SNP 有可 能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代 表疾病遗传机理中的某些作用因素。
6
5
8
通量（Gb）
0.05 0.1
0.5
1
5
25
1
4
16
配对末端测序（Paired-end）3个水稻基因组/天 12个水稻基因组/天 10个水稻基因组/天
读长（bp）
200 400 2×35 2×50 2×100 2×25 2×35 2×50
库序列长度（kb）
3.5
3.5
0.2
0.2
0.2
3
3
2
运行时间（天）
PCR-RFLP原理图
单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。
在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
一、 SNPs经典检测方法
• 一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的 检测方法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR- SSCP ; 3 . 变性梯度凝胶电泳 ( dena t ur i ng gradient gel eletrophoresi s DGGE ); 4 .等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等
SNP的意义（微观）
• 绝大多数位于非转录区，非编码区。 • 少数位于编码区。 • 编码区的意义，同义，错义，移码。 • 非转录区和非编码区的调控功能。
SNP的应用（宏观意义）
• 基因组制图中的应用 • 在种族遗传学和连锁不平衡性分析中的应
用 • 医学中疾病易感性研究中的应用 • 药物基因组学研究中的应用 • 临床耐药研究中的应用 • 遗传育种的应用
MassARRAY技术原理:
• 先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列
特异延伸引物，在 SNP 位点上，延伸 1个碱基。将 制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的 真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离 子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过 检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分 析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。