蛋白质相互作用与定量蛋白质组学ppt课件
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Nature, 2000,403:623-627.
线虫:148个相互作用: Walhout A.J. et al.: Science, 2000, 287: 116-122.
19
四、噬菌体展示技术 (Phage display)
噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的 蛋白或多肽融合表达,将目的蛋白表达在噬菌体颗粒 的外部,在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛 选,十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、 细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单, 将目标肽或蛋白质固定于平板上,铺上噬菌体,噬菌 体外壳融合蛋白与目标肽结合,不能结合的噬菌体颗 粒将被洗掉,再将结合的噬菌体洗下,进行扩增培养, 再进行一到两次的轮回,就能够分离到特定的噬菌体 颗粒。
8
Fields S. and Song O.
A novel genetic system to detect protein-protein interactions.
Nature, 1989, 340: 245-246
9
10
11
12
优点: 酵母细胞几乎能表达所有生物基因。
缺点: 并非所有蛋白质能在酵母核内正常
16
单杂交系统,one hybrid system DNA和蛋白质间相互作用。 鉴定与特定DNA序列直接作用的蛋白质。
三杂交系统,three hybrid system RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用
三者共同作用,才能激活转录。
17
三、酵母双杂交技术在蛋白质组 学中的应用
Interactome 互作组:全面详尽的 蛋白质相互作用图谱。
21
五、表面等离子体共振技术 SPR Surface Plasmon Resonance
研究蛋白质相互作用的新方法。如 瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。
将诱饵蛋白作为配基,固化在几十 纳迷厚的金属膜表面,加入含猎物蛋 白的溶液,如有相互作用会特异性结 合形成蛋白质复合物,使金属膜与溶 液界面的折射率上升,导致共振角度 改变。
行使功能,不正确的蛋白质折叠结构: 假阳性 假阴性
13
Y2H开始以转录因子Gal4为基础,依靠 招募RNA聚合酶II激活转录。
1997:Marsoliter等建立以RNA聚合酶III 为基础的Y2H,假阳性率更低。
反向双杂交系统:reverse two-hybrid system. 构建反向筛选的报告基因(URA3, U合成所必需),蛋白质互作激活报告基因 表达,使细胞不能成活。
病毒、细菌、酵母、线虫等。 T7噬菌体:首先用于大规模Y2H分析:
55个有25个相互作用。 丙型肝炎病毒HCV:编码10个成熟蛋白, 有5个相互作用。
18
酿酒酵母:6000多个ORF, 1996完成 基因组计划,阵列筛选法得到281个相 互作用;文库筛选法得到692个相互作 用: Uetz,P. et al.,
6
一个单转录因子有: DBD: DNA binding domain DNA结合结构域。 AD:Activation domain, 转录激活结构域:能激活RNA聚合
酶起始转录。
7
诱饵蛋白B + DBD:不能起始转录 被捕食蛋白的ORF + AD:不能起始转录。 当诱饵蛋白和被捕食蛋白在同一细胞中 表达,如发生相互作用, RNA聚合酶将 启动报告基因His3转录,合成组氨酸, 如His3不表达,细胞不能生长。
22
特点:
快速、安全,不需标记物和染料, 还可检测蛋白-核酸及其它分子间的相 互作用。
SPR DNA生物传感器可用于基因 突变的检测、PCR产物测定、病毒检 测等。
23
六、蛋白质间连锁图的建立
已建立酿酒酵母1548个蛋白质间 2358个相互作用网络:
Fields, S. Lab: Nat. Biotechnology 2000,18:1257-1261.
第九章
蛋白质相互作用与定量 蛋白质组学研究技术
1
主要内容:
蛋白质相互作用主要研究技术 酵母双杂交技术进展 TAP(Tandem Affinity Purification)技术进展 自动化、高通量酵母双杂交技术和TAP技术 定量蛋白质组学研究技术
2
一、蛋白质相互作用
Protein-Protein Interactions
14
分离杂交系统,split-hybrid system 利用2个相互整合的报告基因。
细胞质中的双杂交系统:
SOS招募系统:
SOS recruitment system
利用Ras信号传导途径的基本性质:
两种蛋白相互作用,就会将hSos
(人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上,激活
Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和
20Biblioteka Baidu
噬菌体展示技术(Phage display)
· Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit · Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit · Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit · Ph.D. Peptide Display Cloning System
24
七、酵母双杂交技术方法
增殖。
15
其他新的双杂交系统:
分离的泛素系统
split-ubiquitin syatem. (PNAS, 1996,91:10340-10344) 利用泛素的功能特点。 当分别与泛素N端和C端部分融合的两 个蛋白质相互作用时,使分离的泛素的 两部分靠近,泛素专一性的蛋白酶就会 识别泛素,导致报道蛋白的解离释放。
3
蛋白质相互作用控制着生命过程的各个方面
4
Yeast Two Hybrid Mass Spectrometry
5
二、酵母双杂交技术及进展
Yeast Two-Hybrid,Y2H.
Fields S. and Song O.:
Nature, 1989, 340: 245-246
研究蛋白质相互作用的方法,利用转 录因子组件式(modular)结构的性 质。Y2H 就是将需要研究的蛋白质设 计成“诱饵”,以钓出能与诱饵蛋白 发生物理相互作用的蛋白质(被捕食 蛋白质)。
线虫:148个相互作用: Walhout A.J. et al.: Science, 2000, 287: 116-122.
19
四、噬菌体展示技术 (Phage display)
噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的 蛋白或多肽融合表达,将目的蛋白表达在噬菌体颗粒 的外部,在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛 选,十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、 细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单, 将目标肽或蛋白质固定于平板上,铺上噬菌体,噬菌 体外壳融合蛋白与目标肽结合,不能结合的噬菌体颗 粒将被洗掉,再将结合的噬菌体洗下,进行扩增培养, 再进行一到两次的轮回,就能够分离到特定的噬菌体 颗粒。
8
Fields S. and Song O.
A novel genetic system to detect protein-protein interactions.
Nature, 1989, 340: 245-246
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10
11
12
优点: 酵母细胞几乎能表达所有生物基因。
缺点: 并非所有蛋白质能在酵母核内正常
16
单杂交系统,one hybrid system DNA和蛋白质间相互作用。 鉴定与特定DNA序列直接作用的蛋白质。
三杂交系统,three hybrid system RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用
三者共同作用,才能激活转录。
17
三、酵母双杂交技术在蛋白质组 学中的应用
Interactome 互作组:全面详尽的 蛋白质相互作用图谱。
21
五、表面等离子体共振技术 SPR Surface Plasmon Resonance
研究蛋白质相互作用的新方法。如 瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。
将诱饵蛋白作为配基,固化在几十 纳迷厚的金属膜表面,加入含猎物蛋 白的溶液,如有相互作用会特异性结 合形成蛋白质复合物,使金属膜与溶 液界面的折射率上升,导致共振角度 改变。
行使功能,不正确的蛋白质折叠结构: 假阳性 假阴性
13
Y2H开始以转录因子Gal4为基础,依靠 招募RNA聚合酶II激活转录。
1997:Marsoliter等建立以RNA聚合酶III 为基础的Y2H,假阳性率更低。
反向双杂交系统:reverse two-hybrid system. 构建反向筛选的报告基因(URA3, U合成所必需),蛋白质互作激活报告基因 表达,使细胞不能成活。
病毒、细菌、酵母、线虫等。 T7噬菌体:首先用于大规模Y2H分析:
55个有25个相互作用。 丙型肝炎病毒HCV:编码10个成熟蛋白, 有5个相互作用。
18
酿酒酵母:6000多个ORF, 1996完成 基因组计划,阵列筛选法得到281个相 互作用;文库筛选法得到692个相互作 用: Uetz,P. et al.,
6
一个单转录因子有: DBD: DNA binding domain DNA结合结构域。 AD:Activation domain, 转录激活结构域:能激活RNA聚合
酶起始转录。
7
诱饵蛋白B + DBD:不能起始转录 被捕食蛋白的ORF + AD:不能起始转录。 当诱饵蛋白和被捕食蛋白在同一细胞中 表达,如发生相互作用, RNA聚合酶将 启动报告基因His3转录,合成组氨酸, 如His3不表达,细胞不能生长。
22
特点:
快速、安全,不需标记物和染料, 还可检测蛋白-核酸及其它分子间的相 互作用。
SPR DNA生物传感器可用于基因 突变的检测、PCR产物测定、病毒检 测等。
23
六、蛋白质间连锁图的建立
已建立酿酒酵母1548个蛋白质间 2358个相互作用网络:
Fields, S. Lab: Nat. Biotechnology 2000,18:1257-1261.
第九章
蛋白质相互作用与定量 蛋白质组学研究技术
1
主要内容:
蛋白质相互作用主要研究技术 酵母双杂交技术进展 TAP(Tandem Affinity Purification)技术进展 自动化、高通量酵母双杂交技术和TAP技术 定量蛋白质组学研究技术
2
一、蛋白质相互作用
Protein-Protein Interactions
14
分离杂交系统,split-hybrid system 利用2个相互整合的报告基因。
细胞质中的双杂交系统:
SOS招募系统:
SOS recruitment system
利用Ras信号传导途径的基本性质:
两种蛋白相互作用,就会将hSos
(人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上,激活
Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和
20Biblioteka Baidu
噬菌体展示技术(Phage display)
· Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit · Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit · Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit · Ph.D. Peptide Display Cloning System
24
七、酵母双杂交技术方法
增殖。
15
其他新的双杂交系统:
分离的泛素系统
split-ubiquitin syatem. (PNAS, 1996,91:10340-10344) 利用泛素的功能特点。 当分别与泛素N端和C端部分融合的两 个蛋白质相互作用时,使分离的泛素的 两部分靠近,泛素专一性的蛋白酶就会 识别泛素,导致报道蛋白的解离释放。
3
蛋白质相互作用控制着生命过程的各个方面
4
Yeast Two Hybrid Mass Spectrometry
5
二、酵母双杂交技术及进展
Yeast Two-Hybrid,Y2H.
Fields S. and Song O.:
Nature, 1989, 340: 245-246
研究蛋白质相互作用的方法,利用转 录因子组件式(modular)结构的性 质。Y2H 就是将需要研究的蛋白质设 计成“诱饵”,以钓出能与诱饵蛋白 发生物理相互作用的蛋白质(被捕食 蛋白质)。