各种标本的提取及pcr反应体系配制
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以上“变性、退火、延伸”三部曲 为PCR一轮循环。
PCR扩增曲线
PCR反应五要素 • 1. 引物（primer） • 2. 酶 （Taq DNA polymera百度文库e） • 3. dNTP
（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
• 4. 模板 （template） • 5. Mg2+ （magnesium）
PCR的基本步骤
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形
成 条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
高温变性
低温退火
中温延伸
PCR 每 一 步 的 转 换 通 过 温 度 的 改 变 控 制 。 DNA 模 板 解 链 （ 变 性 ） 、 引 物 与 模 板 结 合 （ 退 火 ） 、 DNA 聚 合 酶 催 化 新 生 DNA 的 合 成 （ 延 伸 ） 三 个步骤构成PCR反应的一个循环。
PCR的基本步骤
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本步骤
• 1.变性：高温使双链DNA解离形成单 链（94℃，30s）。
• 2.退火：低温下，引物与模板DNA互 补区结合（55℃，30s）。
• 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化 以引物为起始点的DNA链延伸反应 （70～72℃，30～60s）
各种标本的提取及pcr 反应体系配制
1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤 4.PCR反应五要素 5. PCR 的反应流程
PCR的基本原理
• 试管中进行的DNA复制反应，依据 ①DNA半保留复制的机理； ②体外DNA分子于不同温度下可变性
和复性的性质； • 通过人为控制体外合成系统的温度，
形成二聚体的机会
2 .酶及其浓度
目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： – 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 – 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总 反应体积为100µl时）；
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：
G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以 上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的 互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的 酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； ⑧引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的 结果为好 —引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间
– dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降
4.模板（靶基因target gene）
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；
传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标 本；
– SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合 而沉淀； – 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解 病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直 接用于PCR扩增；
RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止 RNase降解RNA
5.Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有 显著的影响;
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200µmol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜;
使 ①双链DNA变成单链， ②单链DNA与人工合成的引物退火， ③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延
伸为双链DNA。
PCR反应体系
• 4种dNTP混合物 • 引物 • 模板DNA • Taq DNA聚合酶 • Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol
0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
此循环反复进行，可使目的DNA得 以迅速扩增。
理 论 扩 增 率 ： 2n 递 增 （ n 为 循 环 次 数 ） ， 25 ～ 30 循 环 ， 目 标 DNA 可 增 加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的 实际扩增率，平均约为75%。
由 于 引 物 和 底 物 的 消 耗 ， 酶 活 力 的 下降等因素，扩增产物的增加，逐渐 由指数形式变为线性形式，所以实际 上进行30个循环后，扩增倍数一般可 达106～107。
– dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活
– dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的 缓 冲 液 将 其 pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解
– 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔 配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几 种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过 低又会降低PCR产物的产量
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。理论上，只要知 道任何一段模板DNA序列，就能按 其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩 增。
引物设计的原则
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，
PCR扩增曲线
PCR反应五要素 • 1. 引物（primer） • 2. 酶 （Taq DNA polymera百度文库e） • 3. dNTP
（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
• 4. 模板 （template） • 5. Mg2+ （magnesium）
PCR的基本步骤
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形
成 条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
高温变性
低温退火
中温延伸
PCR 每 一 步 的 转 换 通 过 温 度 的 改 变 控 制 。 DNA 模 板 解 链 （ 变 性 ） 、 引 物 与 模 板 结 合 （ 退 火 ） 、 DNA 聚 合 酶 催 化 新 生 DNA 的 合 成 （ 延 伸 ） 三 个步骤构成PCR反应的一个循环。
PCR的基本步骤
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本步骤
• 1.变性：高温使双链DNA解离形成单 链（94℃，30s）。
• 2.退火：低温下，引物与模板DNA互 补区结合（55℃，30s）。
• 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化 以引物为起始点的DNA链延伸反应 （70～72℃，30～60s）
各种标本的提取及pcr 反应体系配制
1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤 4.PCR反应五要素 5. PCR 的反应流程
PCR的基本原理
• 试管中进行的DNA复制反应，依据 ①DNA半保留复制的机理； ②体外DNA分子于不同温度下可变性
和复性的性质； • 通过人为控制体外合成系统的温度，
形成二聚体的机会
2 .酶及其浓度
目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： – 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 – 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总 反应体积为100µl时）；
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：
G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以 上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的 互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的 酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； ⑧引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的 结果为好 —引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间
– dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降
4.模板（靶基因target gene）
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；
传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标 本；
– SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合 而沉淀； – 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解 病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直 接用于PCR扩增；
RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止 RNase降解RNA
5.Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有 显著的影响;
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200µmol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜;
使 ①双链DNA变成单链， ②单链DNA与人工合成的引物退火， ③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延
伸为双链DNA。
PCR反应体系
• 4种dNTP混合物 • 引物 • 模板DNA • Taq DNA聚合酶 • Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol
0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
此循环反复进行，可使目的DNA得 以迅速扩增。
理 论 扩 增 率 ： 2n 递 增 （ n 为 循 环 次 数 ） ， 25 ～ 30 循 环 ， 目 标 DNA 可 增 加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的 实际扩增率，平均约为75%。
由 于 引 物 和 底 物 的 消 耗 ， 酶 活 力 的 下降等因素，扩增产物的增加，逐渐 由指数形式变为线性形式，所以实际 上进行30个循环后，扩增倍数一般可 达106～107。
– dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活
– dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的 缓 冲 液 将 其 pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解
– 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔 配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几 种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过 低又会降低PCR产物的产量
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。理论上，只要知 道任何一段模板DNA序列，就能按 其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩 增。
引物设计的原则
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，