液态活检在肿瘤研究的现状和趋势分析
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EMBO Mol Med. 2015 Jan; 7(1): 1–11
与血液细胞相比，肿瘤细胞具有以下特征： 体积更大； 液相流动性更大； 细胞膜的电容和电导特性不同；
CTC临床治疗治疗决策
预后预测不应只是一切的终点，而应是一切的开始
Circulating tumor cells and response to chemotherapy in me tastatic breast cancer: SWOG S0500
2005-Dich F,et.al.Detection and quantification o
f mutation in the plasma of patiens with colorect al tumor Proc Natl Acad Sci USA 102;16368-1637 3
2008-Dichl F,Schmidt K,Choti MA,Romans K,Goo
ctDNA应用—肿瘤实时监测
标签捕获 实时监测
N Engl J Med 2013; 368:1199-1209
进展评估
ctDNA应用—肿瘤进化（耐药）
Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing oБайду номын сангаас plasma DNA
J Clin Oncol. 2009;27(20):3303-3311 J Clin Oncol. 2008;26(19):3213-21 Clin Cancer Res. 2008 ;14(19):6302-9
CTC的生物学功能
Circulating Tumor Cell Clusters Are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis
Nat Rev Clin.Oncol. 2013;10(8):472–84
dman S,Li M,et.al.Circulating mutant DNA to ass css tumor dynamics Nature medicine 2008 14, 9 85 - 990
ctDNA性质
含量低（<1.0%总cfDNA） 片段短（180-200bp）
肿瘤治疗方案选择
ctDNA
1984-Mandel P,Metais P;Les acides nucleiques
du plasma sanguin chez I’homme.C R Seances So c Biol Fil, 142:241- 243
1977-LEON,S.A.et.al.free DNA in the serum of
cancer patients and the effect of therapy.Cancer Res.37;646-650
1989-STROUN,M.et.al.Neoplastic characteristic
s of the DNA found in the plasma of cancer pati ent.Oncology 46;318-322
ctDNA检测方法
数字PCR
J Clin Oncol 2014 Feb 20;32(6):579-86
数字PCR的特点： 极高的敏感性； 只能针对确定的SNP 位点； 可同时检测位点的 通量较低。
目标序列捕获测序-基于PCR
Plasma circulating tumor DNA as an alternative to metastatic biopsies for mutational analysi s in breast cancer
Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer Nat Med. 2014 ;20(8):897-903
Single-cell RNA sequencing identifies extracellular matrix gene expression by pancreatic circulating tumor cells
液态活检（liquid biopsy）
血检
• 循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTCs） • 游离肿瘤DNA（ Circulating tumor DNA，ctDNA或者 Circulating Free DNA，cfDNA）
CTC
CTC—转移过程中必经阶段
CTC： 是否是介导肿瘤转移的细胞？
虽然CTC对接受一线化疗的转移性 乳腺癌患者预后具有重要意义，但 是针对一线化疗后CTCs仍升高的患 者换用其它化疗方案并不能有效地 延长患者生存期。
CTC的分子特征
Solidifying liquid biopsies:can circulating tumor cell monitoring guide treatment selection in breast cancer?
液态活检 在肿瘤研究的现状和趋势分析
内容概括
• 液态活检概念 • 循环肿瘤细胞及其核酸 • 游离肿瘤核酸
组织活检的局限性
• • • • 很多肿瘤患者无法进行手术 穿刺受检者严重的不合适 穿刺自身的临床风险 某些肿瘤解剖位置不便进行 穿刺
• 肿瘤的异质性
阿拉伯医生Albucasis （936-1013）及其发明的外科手术器械 Folia Histochem Cytobiol. 2009年47卷2期191-7页
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):E1317-25 Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985–990
半衰期短（~2小时）
ctDNA的检测对 痕量核酸检测技 术提出全新的挑 战！！
Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985–990
CTC—单细胞测序
Method of the Year 2013
multiple displacement amplification(MDA)
MDA扩增方法优点：
不引入接头序列 SNV假阳性率较低 （—0.001%） 数据不易受外源DNA 污染影响
Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles（MALBAC）
Cell. 2014 28;158(5):1110-22 Cell Rep. 2014 Sep 25;8(6):1905-18
CTC检测方法
CTC确认标准： DAPI染色阳性； 组织来源相关CK染色 阳性； CD45染色阴性； 肿瘤相关抗原染色阳 性 （MUC1，HER2，PSA et al.） 其它辅助方法：FISH ， HE，PCR ， EPISPOT
Clin Cancer Res. 2014;20(10):2643-50
ctDNA分子学层面的缓解与否，是否能够辅助评 估肿瘤手术治疗根治性程度，以减少一部分无需 进行术后辅助化疗的病人接受相应治疗，所承担 的不良反应和经济负担。 Clin Cancer Res. 2014;20(10):2505-7
肿瘤类型，应用方向
特异性的ctDNA实施方案。
谢谢！！！
Nature. 2013;497(7447):108-12
定点检测手段（如 数字PCR），在评 估和监测肿瘤克隆 演化方面具有较大 的局限性。
ctDNA应用—早期诊断
在使用高灵敏度 检测ctDNA突变 方法的前提下， ctDNA的早期肿 瘤中的检出率要 高于CTC。
Sci Transl Med 6, 224ra24 (2014)
MALBAC扩增方法优点：
拟线性扩增，适合CNV 分析； 数据重现性较好
CTC—单细胞测序优势
Whole-exome sequencing of circulating tumor cells provides a window into metastatic prostate cancer
Nat Biotechnol. 2014,32(5): 479–484
较短的区间（6kb）
Sci.Transl.Med. 2012 ,4(136):136ra68
Annals of Oncology, 2014, 25(10):1959-65
目标序列捕获测序—基于探针捕获
An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage
Nat Med. 2014, 20(5): 548–554
NSCLC selector.共125kb,包含了囊括了139个基因的521个外显 子,13个内含子。在测试的两个肺癌病人群体中（229例/183 例），囊盖率达到96%或88%，每个病人可检测到的中位突变 数为4个。
50-105mer/探针，高密度，更适合ctDNA检 测。
对于异质性很强的肿瘤，CTC相比组织单一取材，更全面的代表了 肿瘤组织的异质性，更适合于评估肿瘤的分子特征以及检测肿瘤进 展。
CTC—单细胞测序应用前景及挑战
挑战：
提高CTC的检出率（不
依赖抗体的CTC分离策略， CellCullector TM策略）； 准确地判断具有生物学 活性/功能的CTC （EPISPOT,CAM等策略）； Nat Rev Clin.Oncol 2014;11(3):129-144 CTC细胞分离，单细胞 核酸WGA操作等样品制 CTC的分子特征实时评估将如何更好地辅助于： 备的SOP和QC方案； 肿瘤疗效评估 CTC本身的异质性。 肿瘤转移进展监测和预防
Detection of cancer DNA in plasma of patients with early-stage breast cancer.
Minimal residual disease in breast cancer: in blood veritas.
应该注意到，一些符 合传统根治性标准的 病人，在ctDNA分子 水平上并没有发生显 著缓解。
ctDNA应用—肿瘤基因分型
Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA
Nature med. 2014; 20(4):430-435.
ctDNA应用—微小残留病
ctDNA应用的挑战
高灵敏度的定点检测（SV检测灵敏度1/500000，SNV检 测灵敏度1/200000）无法发现肿瘤演化过程中出现的新突 变。 高通量的NGS方法的灵敏度，由于远低于定点检测，因 此目前仍局限于晚期肿瘤临床应用中。 ctDNA来源的复杂性，使得其在不同疾病间，不同肿瘤 患者个体间差异性较大，这种产生机制上的不确定性， 使得我们对ctDNA数据的注释应更加谨慎。 ctDNAD 变化，可能不能实时反映发生在肿瘤细胞中一 些不依赖于基因组变异的信号通路的变化，例如转录调 控，蛋白翻译后调控，或者表现遗传学调控等。
Treat—CTC: Trastuzumab in HER2negative Early breast cancer as Adjuvant Treatment for Circulating Tumor Cells
在CANCER RESEARCH 全 文下载不到
CTC的简单计数，并不能反应肿瘤细胞内在的生物 学特性，而正是这种特性是决定了不同的肿瘤细胞对治 疗具有不同的反应。因此，对CTC细胞的分子特性（例 如药物靶向基因的表达，药物耐受相关基因突变的检测） 的精细刻画，将有利于充分发掘CTC在指导临床治疗的 价值。
与血液细胞相比，肿瘤细胞具有以下特征： 体积更大； 液相流动性更大； 细胞膜的电容和电导特性不同；
CTC临床治疗治疗决策
预后预测不应只是一切的终点，而应是一切的开始
Circulating tumor cells and response to chemotherapy in me tastatic breast cancer: SWOG S0500
2005-Dich F,et.al.Detection and quantification o
f mutation in the plasma of patiens with colorect al tumor Proc Natl Acad Sci USA 102;16368-1637 3
2008-Dichl F,Schmidt K,Choti MA,Romans K,Goo
ctDNA应用—肿瘤实时监测
标签捕获 实时监测
N Engl J Med 2013; 368:1199-1209
进展评估
ctDNA应用—肿瘤进化（耐药）
Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing oБайду номын сангаас plasma DNA
J Clin Oncol. 2009;27(20):3303-3311 J Clin Oncol. 2008;26(19):3213-21 Clin Cancer Res. 2008 ;14(19):6302-9
CTC的生物学功能
Circulating Tumor Cell Clusters Are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis
Nat Rev Clin.Oncol. 2013;10(8):472–84
dman S,Li M,et.al.Circulating mutant DNA to ass css tumor dynamics Nature medicine 2008 14, 9 85 - 990
ctDNA性质
含量低（<1.0%总cfDNA） 片段短（180-200bp）
肿瘤治疗方案选择
ctDNA
1984-Mandel P,Metais P;Les acides nucleiques
du plasma sanguin chez I’homme.C R Seances So c Biol Fil, 142:241- 243
1977-LEON,S.A.et.al.free DNA in the serum of
cancer patients and the effect of therapy.Cancer Res.37;646-650
1989-STROUN,M.et.al.Neoplastic characteristic
s of the DNA found in the plasma of cancer pati ent.Oncology 46;318-322
ctDNA检测方法
数字PCR
J Clin Oncol 2014 Feb 20;32(6):579-86
数字PCR的特点： 极高的敏感性； 只能针对确定的SNP 位点； 可同时检测位点的 通量较低。
目标序列捕获测序-基于PCR
Plasma circulating tumor DNA as an alternative to metastatic biopsies for mutational analysi s in breast cancer
Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer Nat Med. 2014 ;20(8):897-903
Single-cell RNA sequencing identifies extracellular matrix gene expression by pancreatic circulating tumor cells
液态活检（liquid biopsy）
血检
• 循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTCs） • 游离肿瘤DNA（ Circulating tumor DNA，ctDNA或者 Circulating Free DNA，cfDNA）
CTC
CTC—转移过程中必经阶段
CTC： 是否是介导肿瘤转移的细胞？
虽然CTC对接受一线化疗的转移性 乳腺癌患者预后具有重要意义，但 是针对一线化疗后CTCs仍升高的患 者换用其它化疗方案并不能有效地 延长患者生存期。
CTC的分子特征
Solidifying liquid biopsies:can circulating tumor cell monitoring guide treatment selection in breast cancer?
液态活检 在肿瘤研究的现状和趋势分析
内容概括
• 液态活检概念 • 循环肿瘤细胞及其核酸 • 游离肿瘤核酸
组织活检的局限性
• • • • 很多肿瘤患者无法进行手术 穿刺受检者严重的不合适 穿刺自身的临床风险 某些肿瘤解剖位置不便进行 穿刺
• 肿瘤的异质性
阿拉伯医生Albucasis （936-1013）及其发明的外科手术器械 Folia Histochem Cytobiol. 2009年47卷2期191-7页
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):E1317-25 Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985–990
半衰期短（~2小时）
ctDNA的检测对 痕量核酸检测技 术提出全新的挑 战！！
Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985–990
CTC—单细胞测序
Method of the Year 2013
multiple displacement amplification(MDA)
MDA扩增方法优点：
不引入接头序列 SNV假阳性率较低 （—0.001%） 数据不易受外源DNA 污染影响
Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles（MALBAC）
Cell. 2014 28;158(5):1110-22 Cell Rep. 2014 Sep 25;8(6):1905-18
CTC检测方法
CTC确认标准： DAPI染色阳性； 组织来源相关CK染色 阳性； CD45染色阴性； 肿瘤相关抗原染色阳 性 （MUC1，HER2，PSA et al.） 其它辅助方法：FISH ， HE，PCR ， EPISPOT
Clin Cancer Res. 2014;20(10):2643-50
ctDNA分子学层面的缓解与否，是否能够辅助评 估肿瘤手术治疗根治性程度，以减少一部分无需 进行术后辅助化疗的病人接受相应治疗，所承担 的不良反应和经济负担。 Clin Cancer Res. 2014;20(10):2505-7
肿瘤类型，应用方向
特异性的ctDNA实施方案。
谢谢！！！
Nature. 2013;497(7447):108-12
定点检测手段（如 数字PCR），在评 估和监测肿瘤克隆 演化方面具有较大 的局限性。
ctDNA应用—早期诊断
在使用高灵敏度 检测ctDNA突变 方法的前提下， ctDNA的早期肿 瘤中的检出率要 高于CTC。
Sci Transl Med 6, 224ra24 (2014)
MALBAC扩增方法优点：
拟线性扩增，适合CNV 分析； 数据重现性较好
CTC—单细胞测序优势
Whole-exome sequencing of circulating tumor cells provides a window into metastatic prostate cancer
Nat Biotechnol. 2014,32(5): 479–484
较短的区间（6kb）
Sci.Transl.Med. 2012 ,4(136):136ra68
Annals of Oncology, 2014, 25(10):1959-65
目标序列捕获测序—基于探针捕获
An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage
Nat Med. 2014, 20(5): 548–554
NSCLC selector.共125kb,包含了囊括了139个基因的521个外显 子,13个内含子。在测试的两个肺癌病人群体中（229例/183 例），囊盖率达到96%或88%，每个病人可检测到的中位突变 数为4个。
50-105mer/探针，高密度，更适合ctDNA检 测。
对于异质性很强的肿瘤，CTC相比组织单一取材，更全面的代表了 肿瘤组织的异质性，更适合于评估肿瘤的分子特征以及检测肿瘤进 展。
CTC—单细胞测序应用前景及挑战
挑战：
提高CTC的检出率（不
依赖抗体的CTC分离策略， CellCullector TM策略）； 准确地判断具有生物学 活性/功能的CTC （EPISPOT,CAM等策略）； Nat Rev Clin.Oncol 2014;11(3):129-144 CTC细胞分离，单细胞 核酸WGA操作等样品制 CTC的分子特征实时评估将如何更好地辅助于： 备的SOP和QC方案； 肿瘤疗效评估 CTC本身的异质性。 肿瘤转移进展监测和预防
Detection of cancer DNA in plasma of patients with early-stage breast cancer.
Minimal residual disease in breast cancer: in blood veritas.
应该注意到，一些符 合传统根治性标准的 病人，在ctDNA分子 水平上并没有发生显 著缓解。
ctDNA应用—肿瘤基因分型
Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA
Nature med. 2014; 20(4):430-435.
ctDNA应用—微小残留病
ctDNA应用的挑战
高灵敏度的定点检测（SV检测灵敏度1/500000，SNV检 测灵敏度1/200000）无法发现肿瘤演化过程中出现的新突 变。 高通量的NGS方法的灵敏度，由于远低于定点检测，因 此目前仍局限于晚期肿瘤临床应用中。 ctDNA来源的复杂性，使得其在不同疾病间，不同肿瘤 患者个体间差异性较大，这种产生机制上的不确定性， 使得我们对ctDNA数据的注释应更加谨慎。 ctDNAD 变化，可能不能实时反映发生在肿瘤细胞中一 些不依赖于基因组变异的信号通路的变化，例如转录调 控，蛋白翻译后调控，或者表现遗传学调控等。
Treat—CTC: Trastuzumab in HER2negative Early breast cancer as Adjuvant Treatment for Circulating Tumor Cells
在CANCER RESEARCH 全 文下载不到
CTC的简单计数，并不能反应肿瘤细胞内在的生物 学特性，而正是这种特性是决定了不同的肿瘤细胞对治 疗具有不同的反应。因此，对CTC细胞的分子特性（例 如药物靶向基因的表达，药物耐受相关基因突变的检测） 的精细刻画，将有利于充分发掘CTC在指导临床治疗的 价值。