亲水作用色谱HILIC实用指南

指导与应用手册· 1

亲水作用色谱 HILIC实用指南

指导与应用手册

2 · HILIC实用指南

亲水作用色谱(HILIC)实用指南

原著作书名:A Practical Guide to HILIC

原著作者:Patrik Appelblad, Tobias Jonsson, Einar Pontén, Camilla Viklund and Wen Jiang

中文版编辑：Wen Jiang (江文）

ISBN 978-91-631-8370-6

瑞典SeQuant AB出版, 地址: Box 7956, 907 19 Umeå, Sweden.

版权所有© 2005-2008, SeQuant AB

2008年2月第一版，第一次印刷，瑞典于默奥(Umeå)

修订及额外资料可以在Merck SeQuant公司网页上找到，网址。如有其它问题及信息反馈，请与info@联系。

HILIC实用指南

–指导与应用手册

引言

本手册旨在介绍一种适用于分析强极性和强亲水化合物的液相色谱分析方法–亲水作用液相色谱(H ydrophilic I nteraction Li quid C hromatography，HILIC)。主要介绍HILIC的基本理论和该分离模式下的一些实际问题，同时给读者介绍瑞典SeQuant 公司的ZIC ®-HILIC(硅胶基质)和ZIC ®-p HILIC(聚合物基质) 两性离子液相色谱柱(见图1)，以及使用这两种色谱柱分析不同类型亲水化合物的应用实例。您也会从本手册中获得该类色谱和其他方

面的色谱知识。

图1 ZIC ®-HILIC和ZIC ®-p HILIC两性离子固定相的官能团

如果本手册不能解决您的HILIC 问题，SeQuant愿为你提供进一步帮助。首先，建议您登陆SeQuant 公司网站主页()，从那您能找到关于我们产品的最新文献资料、应用报告和技术数据。如果您还需要其他信息，SeQuant工作人员乐意为您提供更进一步帮助,请与我们的技术支持联系(support@)。

为什么使用HILIC?

尽管反相液相色谱（RPLC）是至今应用最广的色谱分离技术，它能与各种常规的检测方法结合，解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很少保留。长期以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利环保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。

但是在这种实验条件下，很多极性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了NPLC的应用范围。从现在起有了另一种新的解决办法，即选用亲水作用液相色谱-HILIC。在HILIC色谱柱上，物质的洗脱顺序与RPLC恰恰相反，如图2所示。换句话说，在RPLC柱上很难保留或根本不保留的物质，在通常的实验条件下，它们在HILIC柱上有较强的保留。

图2 小肽在HILIC和RPLC柱上的分离 色谱柱: 1) ZIC ®-HILIC，150 x 4.6 mm；2) Kromasil ® C18, 150 x 4.6 mm；流动相：HILIC-60/40 (v/v) 乙腈/10mM乙酸铵，pH 7；RPLC-5/95 (v/v) 乙腈/10mM乙酸铵，pH 7；样品: 1) Phe-Gly-Gly-Phe；2) Leu-Gly-Gly；3) Gly-Gly-Gly

HILIC技术和传统的NPLC有很多相似的

之处，但又和它有很大的不同，最重要的不同点是它使用与RPLC的流动相组份相似的半水溶性流动相，使待分析物和样品的基质在流动相中的溶解度大大提高。典型的HILIC流动相是由水或挥发性缓冲盐溶液以及40-97％的乙腈组成的，这些决定了HILIC很适合与质谱检测器(MS)或蒸发光散射检测器(ELSD)联用。在分析亲水化合物时，如将反向色谱改换成亲水作用色谱，检测灵敏度通常会提高10-1000倍。另外，使用亲水作用液相色谱还可避免使用离子对试剂，这对于制备型色谱分离是很有益的。

4 · HILIC实用指南

HILIC的色谱系统

HILIC色谱系统在仪器结构上与RPLC相同。但由于其流动相与RPLC相似，人们可能会试图使用RPLC常规的样品制备和净化方法用于HILIC分析，这样往往会给广大色谱工作者制造很多麻烦。因此，随后的几个章节将详细讨论HILIC色谱系统的关键部件以及成功操作的方法，同时也会描述这些建议的理论根据。

HILIC色谱柱

HILIC柱的固定相是亲水的，而且通常在一定pH范围内是带电荷的。待分析物与固定相相互作用在一般情况下是：亲水性越强的化合物，被保留的时间越长。和大多数其他液相色谱技术不同的是HILIC的部分流动相是作为固定相的一部分来起作用的(具体原理在下面章节介绍)，因此关键的是要在流动相中保持一定量的水。一般情况下，水的比例应保持在3-60%的水平。

HILIC的保留特性

在HILIC工作条件下，固定相表面会首先建立一个富集水的液体层，待分析物在流动相和该亲水层之间进行分配，从而实现分离(见图3)。这是一个典型的放热过程，氢键作用和偶极间的相互作用是影响保留强弱的主要因素。当然氢键作用的大小会取决于物质的酸碱度，而偶极-偶极相互作用会取决于物质的偶极矩与极化性。

HILIC固定相的主要作用是固定水，但如果固定相是带电荷的，离子静电作用也会影响化合物在色谱柱上的保留。图3示意性地描述了两性离子固定相对极性和亲水化合物的保留机理。

二级交互作用

除了HILIC中亲水分配的初级保留作用以外，带电荷的固定相往往提供第二个十分重要的、有选择性的保留作用，也就是它的选择性大小还取于待分析物和固定相上电荷之间的静电作用。降低静电作用可以通过提高流动相中 盐或缓冲盐的浓度来调节。高缓冲盐浓度破坏固定相与待分析物的相互作用，把分析物有效地洗脱出来。但是，高的的缓冲盐浓会增加质谱检测的离子抑制现象，从而对检测灵敏度产生负面影响。然而在两性离子固定相中，每个电荷的静电作用都会被邻近的反向电荷部分地平衡或抵消，因此，总的静电作用是比较弱的，见图4。

较弱的静电作用允许流动相使用较低的缓冲盐浓度，这对提高质谱检测器(MS)的检测灵敏度是有利的。中性的HILIC固定相一般也需要较低的缓冲液浓度，但它缺乏带电荷固定相

的二级选择性。

图3 两性离子固定相上通过亲水分配和与静电作用的分离的HILIC保留机理

1) 待分析物在流动相和固定相水层间的亲水分配作用；2) 待分析物与固定相季胺阳离子的静电作用；3) 待分析物与磺酸根阴离子的静电作用。

图4 血管舒缓激肽(pI 12)在不同HILIC固定相上的保留；色谱柱：100 x 4.6 mm；1) 两性离子色谱柱；2) 纯硅胶色谱柱。流动相：40/60 (v/v)乙腈/50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5