第十三章 体外受精与动物克隆技术

鱼”新品种。
四、哺乳类的细胞核移植
1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实 验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只 单亲小鼠。
1958年到1962年，英国剑桥大学的John Gurdon和Machineer利用爪 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾． 1970年John Gurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核 试验，蛙卵发育成了蝌蚪。
三、鱼类的核移植
从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍
鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移 植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细 胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细 胞核的影响．
（2）卵母细胞的选择
（3）卵母细胞的成熟培养
3. 体外受精
（1）常规体外受精技术
将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。通常情
况下，受精液与获能液为同一种液体。
（2）与分离精子相结合的体外受精技术
将精子分离技术与体外受精技术结合起来生产预选性别的优良胚胎, 对加速
家畜品种改良和畜牧业生产具有重要的应用价值。
研究中取得了令人瞩目的成就。
一、 体外受精
体外受精(In Vitro Fertilization，IVF)是指哺乳动物的精子和卵子在 体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，它的基本原理是在人工模 拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等），使卵丘
卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。
5．胚胎采集
（1）手术法
（2）非手术法
6．胚胎的检查与鉴定
1）检卵 将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10一15分钟。胚胎沉底后，移去上层
液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，在实体显微镜下先在低倍(10
一20倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50—100倍)下观察胚胎质量。 2）吸卵 吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确，速度快，带液量少， 无丢失。吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的 吸卵管。 3）胚胎质量鉴定
2. 胚胎分割目前存在的问题和发展前景
尽管胚胎分割技术已在多种动物包括人类取得成功，但是仍然存在很多问题
须作深入研究。（1）胚胎分割产生的后代初生体重低，在牛切割胚胎移植实践
中发现，有些分割胚即使培养到囊胚阶段与正常胚胎相比，细胞数明显减少，移 植后代的体重也相应降低。这可能与早期胚胎细胞的分化和定位有关，但发育机 理还有待深入研究。（2）还有遗传一致性问题，同一胚胎切割后获得的后代， 在理论上，遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。人们发现6~7日龄牛胚胎 分割后，同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同，而在2-细胞阶段分割，却表 现出遗传一致性。这种现象与胚胎细胞的分化有密切关系，但目前对不同阶段胚
8 ．胚胎移植的意义
①发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广
应用；②缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；③长期保存
冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；④是胚胎分割、胚胎嵌合、
性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的
重要手段。
三、胚胎分割技术
（3）显微受精技术
为了提高体外受精的成功率，借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质或 透明带下，完成受精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精 障碍，使受精率和准确率大大提高。
4. 受精卵的体外培养
受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受
体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，
核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技
术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两
个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造
无性杂交生物新品种的一项技术。
胚 胎 克 隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段 的胚胎，叫做胚胎克隆。 体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做 体细胞克隆。
非手术移植一般在发情后第六至第九天(即胚泡阶段)进行，过早移植会影
响受胎率。在非手术移植中采用胚胎移植枪和0．25毫升细管移植的效果较 好。将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸人含胚胎的
少许保存液，吸人一个气泡，最后再吸取少许保存液。将装有胚胎的吸管
装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。非手术移植要严 格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。
肉注射氯前列烯醇（PGF2α的类似物）各两支（0.2mg/支）。
3．同步发情
同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整 一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。
4．人工受精
激素注射结束后，观察到发情后１２小时，开始第一次输精，时隔１２小时
进行第二次输精，输精量是常规量的两倍 。
体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获 能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育 及试管胚胎的移植等。
1. 精子的获能处理
张明觉Austin 1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受 精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精
子的获能（capacitation）。
胎细胞的分化时间和发育潜力了解很少；（3）最后还存在同卵多胎的局限性，
从目前的研究来看，由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。迄今， 最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊，这说明孪生胚胎的发育潜力很有限。 因此，通过胚胎分割技术生产大量克隆动物目前难以取得进展。
第二节 核移植与动物割法
该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将 胚胎均匀一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。
（3）酶软化透明带后显微分割法
用0.5%的链霉蛋白酶软化胚胎透明带, 若是紧密化胚胎(如桑椹胚) , 则需在无钙、镁的平衡 盐溶液中处理20 分钟, 使胚胎去紧密化，将胚胎固定，把将针置于欲分割的胚胎上面, 使其与胚 胎呈30 度角, 对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。
正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外
膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能 用于移植。
7．胚胎移植
1）手术移植 先将受体母牛作好术前准备。已配种母牛，在右肋部切口，找到非排卵 侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注人胚胎； 未配母牛在每侧子宫角各注入一个胚胎；然后将子宫复位，缝合切口。 2）非手术移植
5 . 体外受精的意义
家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进步，为实现动物
胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家
畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要 的科学意义和实用价值。
二、胚胎移植技术
所谓胚胎移植（embryo transfer）也称受精卵移植，是指将良种 母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎， 移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术， 所以也称为“借腹怀胎”。
所谓胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成 二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生 或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。
1. 胚胎分割的方法
（1）显微针分割法
该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操作仪下将胚胎固定，用玻璃针在透明带上 作一切口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使之离散，将其装入2个预先准备好的空透 明带内，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。
动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的 技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体 细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中 之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚 胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中， 可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的 动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不 经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构 与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克 隆。
第十三章
体外受精与动物克 隆技术
第一节 胚胎工程
胚胎工程是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产 和临床上具有广泛的应用，它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚 胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。近30年来，随着生物
技术的发展，胚胎工程技术也日新月异，在促进畜牧业发展及其相关领域
试管小鼠(Whit-tingham，1968)
大鼠(Toyoda和Chang，1974)
婴儿(Steptoe和Edwards，1978) 牛(Brackett等，1982) 山羊(Hamda，1985) 绵羊(Hanada，1985) 猪(Chang等，1986) 牛（Parrish等，1986）
1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中 冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中 收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正 常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体兔的输卵管中，其中4只妊娠，并产下 15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受 精技术的建立。
1979年，中国科学院武汉水生物研究所
利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细 胞经过385天59代连续传代培养后，再将此 种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受 精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了 两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。
1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细 胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同 种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核
（4）酶消化去透明带后分割法