转基因动物及克隆动物
转基因动物与克隆动物的区别
转基因动物与克隆动物的区别：转基因，用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物[1]。
由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动（有性繁殖）。
克隆，通常是一种生物技术，以人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（例如：植物），产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。
一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。
基因工程的内容，原理，步骤：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术[1]；取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；构建基因的表达载体；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
基因工程是人类根据一定的目的和设计,对DNA 分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术现代生物工程：现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技；可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。
[1]生态系统(Ecosystem)是指在一个特定环境内，相互作用的所有生物和此一环境的统称。
此特定环境里的非生物因子（例如空气、水及土壤等）与其间的生物之间具交互作用[2]，不断地进行物质的交换和能量的传递，并借由物质流和能量流的连接，而形成一个整体，即称此为生态系统或生态系。
中国的环保策略：科学协调行业间关系，制定持续发展规划；实现森林资源的供需平衡，持续利用；建立自我调节的生态系统；提高人们的“绿色环保”意识；完善相关法律并严格执行；林业的可持续发展，城市的可持续发展公害public nuisance，凡由于人类活动污染和破坏环境，对公众的健康、安全、生命、公私财产及生活舒适性等造成的危害均为公害，由于大气污染、水体污染、噪声污染、振动、恶臭等所影响和侵害的是不特定的公众，所以由此产生的危害一般均称为公害。
转基因动物(Transgenic animals )
染色体较短，基因种类丰富，最活跃致病染色体（基 因密度在17、19、22号染色体上最高）。
其基因变异与免疫反应、精神分裂、心脏病、弱 智、白血病以及多种癌症相关。人体全部遗传密码图 谱绘制完毕，大量关于人类生长、发育、衰老、遗传 病变秘密随之揭开。
今后100年—200年生命科学奠定基础。随着对人 体致病基因展开全面搜索——了解各种基因功能及基 因之间相互作用。
Transgenic animals （转基因动物）
Clone animals (克隆动物)
博、硕士研究生
本次课所掌握内容
• 基因病的分类 • 基因在医学领域的用途 • 反求生物学 • 转基因动物及实施细则 • 转基因动物的应用 • 克隆动物的概念和技术过程
日本科学家培了一种新的基因改老鼠，它们不具备 感知危险气味的能力，对其“死对手”猫一点都不 觉得害怕，相反还大胆地在猫身上爬来爬去，甚至 依偎在猫身边。此研究发表《自然》杂志上。
这种鼠通过基因改造，失去其鼻腔特殊感受器， 是专门嗅知食物或捕食者气味的器官。科学家此做 是为更加了解嗅觉的机理。老鼠可以通过其它嗅觉 细胞来探知气味，可惜没有关键路线来触发大脑产 生恐惧感，当“死对手”猫或酸性化学物或其它凶 险化合物在场时，它们也不感到害怕。
为证实这一点，科学家将这种鼠放在猫身上，只见 它又闻又吻，还与猫玩耍起来。为进一步探测这些 老鼠对危险的感知能力，研究人员还将老鼠放在一 个能产生疼痛感的旋转平台上，还放些捕食动物如 雪豹和狐狸的尿液让它们闻，看老鼠是否害怕。结 果发现，这些老鼠开始小心翼翼，之后很好奇，没 有一点害怕的表现。
转基因动物
转基因动物还将是人类最好的"器官库"， 提供从皮肤、角膜，到心、肝、肾等几 乎所有的"零件"。让器官移植专家有充分 施展才华的用武之地，让体内部分"零部 件"出了故障的病人重获生的希望。
克隆动物的操作过程中，完全可以同时 进行转基因操作。在体细胞去核并与去 核的卵细胞结合之前，将有关的人类基 因注入，这样，培育的"转基因克隆羊"， 就会产生出人类蛋白质。
所谓转基因动物，是用实验方法，把外 源基因导入到动物体内，这种外源基因 与动物本身的染色体整合，这时外源基 因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得 到表达，并能传给后代。
世界上第一只转基因动物巨鼠，是将大 白鼠生长激素导入小白鼠的受精卵中， 再将这个受精卵移入借腹怀胎的母鼠子 宫中，产下的小白鼠比一般的大一倍。 这只在遗传学上具有重大意义的转基因 动物的研究培育成功，展现出诱人的光 明前景。
第一头克隆羊"多利"引起的轰动，在于它 的理论价值，它突破了有性生殖的框架， 证明高等动物也可以由无性生殖来繁衍。 我国转基因羊研究新突破，在于它的经 济价值，因为它可以让人类丰衣足食、 健康长寿的美梦成真。
那转基因羊的后代是不是转基因羊呢?转 基因羊与普通羊交配，即有性繁殖，后 代中的一半是转基因羊；但若用克隆--无 性繁殖的方法，那所有的后代都是转基 因羊。
1997年2月，第一头无性繁殖的克隆羊" 多利"现世，标志着克隆哺乳动物的成功， 更有利于转基因动物的培育和利用。 在分子水平或者基因水平的基础上，用 人工的手段去改造生物遗传性状的基因 工程，出现在20世纪70年代。
基因工程应用技术之一的基因重组，可 用于对不同生物遗传物质的体外人工剪 切、组合、拼接，使遗传物质重新组合， 然后，通过载体，如微生物、病毒等转 入微生物或细胞内，进行"无性繁殖"，并 使所需基因在细胞内表达出来，产生人 类所需的物质或创造新的物种。
转基因动物(Transgenic animals )
改变现有医生看病模式：
巴德年：“未来医学应该是3P医学，即预见、预 防、个人化”。患者拥有记载个人生理和病理奥秘 基因组图，录制磁盘，看医生带上磁盘即可。医生 根据磁盘上遗传信息，做出综合评估——将来信息 化医疗将成为主流医学。
诊断技术更新：
目前临床是表型诊断，一旦确定，疾病已经发生。 以后在基因水平上提供诊断依据，产生基因诊断也称 DNA诊断技术。病因性基因异常，发病前即已存在， 进行病前、产前、甚至早期胚胎诊断。疾病早防、早 诊、早治均有重要价值。
应用领域：生物高新技术，该技术所取得成果 展示转基因动物技术在分子生物学、分子遗传 学、分子免疫学、分子药理学、肿瘤工程学、 医学及畜牧学等领域有无限广阔应用前景。 实施细则：研究癌基因的作用及癌细胞发生、 发展及抑制机理；免疫系统中细胞及因子相互 作用；发育中基因表达、调控等提供了大量资 料。集实验动物活体内整体水平、细胞水平和 分子水平为一体，更能体现生命整体研究效果。
合理用药中应用： 合理用药核心是个体化给药，目前主要测定药 物体液浓度，药物动力学原理计算参数。对于血 药浓度与药效相一致的药物可行，对血药浓度与 药效不一致药物，不能达到合理个体化给药。两 个病人诊断相同，同一药物治疗，血药浓度相同， 疗效不同，传统药物动力学、
药效学原理无法解释。要考虑到药物作用相关 位点（受体）是否发生变异？药物作用位点变 异可能发生在基因水平，也可能发生在翻译， 转录水平，基因水平变异相对比较容易鉴定 （研究表明，基因变异与药物效应差异更具相 关性），药物基因组学在临床合理用药中应用 前景广阔，以前无法解释的药效学现象找到了 答案。
1998年与2005年药物基因组学市场（百万美圆）
适应症 1998年 2005年
心血管病
动物遗传工程学的关键技术与应用
动物遗传工程学的关键技术与应用动物遗传工程学是一门研究利用基因工程技术对动物进行遗传改良和基因治疗的学科。
随着遗传技术的飞速发展，动物遗传工程学在农业、医学和生态保护等领域发挥了重要作用。
本文将重点介绍动物遗传工程学中的关键技术和应用。
一、基因编辑技术基因编辑技术是动物遗传工程学的核心技术之一，主要包括CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN等。
这些技术通过针对特定基因序列的剪切和修复，实现对动物基因组的精准编辑。
基因编辑技术可以用于研究基因功能、调控基因表达并修复遗传缺陷等。
例如，科学家们利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠基因，成功模拟多种人类遗传疾病，为人类疾病的治疗提供了重要的研究模型。
二、转基因动物技术转基因动物技术是将外源基因导入到目标动物的基因组中，实现人工改良或新增功能的一种方法。
这项技术最早应用于农业领域，用于培育耐病、高产的转基因动物品种。
随着科学研究和医学需求的不断演进，转基因技术也被应用于人类医学领域。
例如，转基因小鼠模型可以用于研究人类疾病的发生机制以及新药的研发，为临床治疗提供重要依据。
三、胚胎干细胞技术胚胎干细胞技术是指通过体外培养和诱导，从早期胚胎中获得的多能干细胞。
这些干细胞具有分化为各种不同细胞类型的能力，可以为遗传病治疗和组织器官再生提供细胞资源。
例如，利用胚胎干细胞技术，科学家可以培育出特定组织或器官的“工厂”，为治疗心血管疾病、神经系统疾病等提供了新思路。
四、基因治疗基因治疗是一种通过引导和修复患者体内缺陷基因的治疗方法。
这项技术可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病等。
当我们发现有害基因或缺失的基因时，可以使用载体将正常的基因导入到患者体内，恢复正常基因的功能。
基因治疗在动物疾病模型上的研究已经取得了显著成果，为人类疾病的治疗提供了新的思路和希望。
五、克隆技术克隆技术作为动物遗传工程学的重要手段之一，是通过体细胞核移植或胚胎分裂来复制动物个体。
分子生物学吕社民转基因生物与基因打靶
01
02
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同源重组的分子过程
二、基因敲除的基本程序
1 、构建打靶载体 1）同源序列 2） 打靶载体常含两种筛选标志 neor ：新霉素抗性基因，阳性筛选标志， neor基因插入用于打靶的外源DNA中，当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。
显微注射法 ：
01
用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。
02
特点：导入速度快，操作简单，对DNA大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。
03
缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死
法把外源基因导入精子，令其与卵子结合，受精。
接受外源基因的个体的产生
受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕动物子宫→胚胎→个体。 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 →基因操作→注射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合个体
转基因动物模型的建立
建立鼠系
染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行斑点杂交，Southern杂交和PCR分析，原位杂交等以评估外源基因的整合情况。
基因打靶与肿瘤的研究 研究基因改变与肿瘤发生及治疗的关系
基因打靶可用于构建高效的动物反应器或植物反应器，用于药物生产。
02
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三 、基因打靶在医学中的应用
转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性的突破。它为我们培育新的物种提供了新的思路，为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供了有力的手段。
用于疾病相关的研究及建立疾病的动物模型
实验动物学要点
名词解释1、无特定病原体动物（Specific Pathogen free, SPF) ）是指动物机体内无特定的（潜在）病原微生物和寄生虫存在的动物。
除清洁级动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染和对科学实验干扰大的病原（肺炎病毒和呼肠狐病毒III型）的动物，又称SPF动物。
饲养于屏障环境。
2、清洁级动物（ Clean animal ， CL ）是指除普通动物应排除的病原体外，不携带对动物健康危害大和对科学研究干扰较大的病原的动物，如鼠痘病毒、鼠肝炎病毒、仙台病毒、体外寄生虫等，饲养于屏障环境。
3、悉生动物：也称已知菌动物或已知菌丛动物，是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物。
属四级动物，饲养于隔离系统。
分为单菌、双菌和多菌动物。
4、实验动物(Laboratory animals)是指经人工饲育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。
5、3R原则：即替代(replacement）、减少（reduction）和优化(refinement）。
3R原则的推进，最终将使实验动物的使用量逐渐减少，动物实验结果的准确性、可靠性不断提高。
6、转基因动物：指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。
整合到动物染色体基因组的外源基因被称为转基因。
7、克隆动物：即动物的无性繁殖，主要借助于核移植技术，将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即被激活，分裂并发育成个体，使得核供体的基因得到完全复制。
8、近交系(inbred strain)：经过至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可以追溯到起源于第20代或以后的一对共同祖先。
近交系的近交系数应当大于98.6%。
其特点为：1.基因纯合性；2.遗传稳定性3.同源性；4.表型均一性；5.个体性；6.可分辨性；7.分布的广泛性；8.资料的可查性。
9、杂交群：两个近交系动物之间进行有计划交配所获得的第一代动物，称为杂交群动物（Hybrid strain），简称F1动物。
转基因、基因克隆与基因敲除技术
内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配
杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
黑色雌性大鼠
B 、 制 备 基 因 敲 除 动 物 （ 小 鼠 ）
来自褐色大鼠
1、Neor （neomycin-resistance gene)基因：阳性 筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。
1号发生位点同源重组，在G418培养基中生长；
2号为随机插入重组，带入tk基因，可在G418培养基中生长，但 在gangcyclovir培养基中被杀死；
3号未发生任何重组，为正常细胞，在G418培养基中被杀死。
抵抗G418的基因 1 2 tk基因 3
B、制备基因敲除动物（小鼠）
1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡 中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质） 2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。 3、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干细 胞来自褐色小鼠，正常胚胎来自黑色小鼠。 4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色 的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲 除。 5、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。
G418（也称遗传霉素）是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉 素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻 断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、 植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常 用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方 后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产 物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有 Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ,已在基 因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应 用。
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（3） 受精卵的显微注射
注射前
中注 射
注射后
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（4） 受精卵的移植
受体假孕鼠的制备：
母鼠与结扎公鼠合笼（与供体鼠同步）
假孕鼠的挑选
注射后收集卵的移植
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受精卵的移植
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（5） 得到founder转基因小鼠
（6） 对founder转基因小鼠进 行鉴定、筛选、杂交获得纯合转 基因小鼠
2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎 后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括 生殖细胞在内的所有组织。
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原理
将外源目的基因导入ES细胞，再移入 胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎 移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由 胚胎干细胞介导的转基因动物。
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关键步骤
①ES细胞的分离培养
②ES细胞基因操作
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（二）逆转录病毒法
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关于逆转录病毒
1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病 毒类的总称。
2. 2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作 用下可以将本身的单链RNA作为模板进
行复制和遗传信息的传递。
3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主 细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。
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（一）显微注射法
（以培育转基因小鼠为例）
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1.方法
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显微注射制作转基因动物流程图
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2.具体步骤
（1）前期准备
实验动物：供体鼠 、 受体鼠 、结扎雄鼠
仪器设备：拉针仪 、煅针仪、体视镜、显微注射仪
实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、 透
明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、 M16 、注射用矿物油、注射针、持卵针
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显微注射仪
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体视镜
煅针仪
拉针仪 编辑ppt
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（2） 受精卵的采集
供体鼠超排：
PMSG,ip HCG,ip 48hr
输卵管膨大部受精卵的采集
受精卵消化、洗涤、培养
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受精卵的采集
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受精卵的消化、培养
消化、洗涤后受精卵
原核清晰的受精卵
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嵌合体动物（Chimeric animal）
部分组织细胞中整合有外源基因 组的动物
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三、转基因动物培育原理
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四、方 法
➢ 显微注射法 ➢ 逆转录病毒法 ➢ ES（胚胎干细胞）法
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➢ 精子载体法
➢ 脂质体载体法 ➢ 电脉冲法 ➢ 基因枪法 ➢ 体细胞核移植技术（转基因克隆技术）
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转基因鼠
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5只克隆出的转基因小猪 Noel、Angel、Star、Joy和Mary。
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12
全球首只转基因猴“Andy”
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转基因鱼
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转基因试管牛“滔滔”
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英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图
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（2）包装细胞
决定着重组病毒效价及其宿主范围。 常用φ-2细胞株
（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎
载体转染包装细胞后与8细胞胚胎 共培养进行转染
（4）胚胎移植 （5）建系
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（三）胚胎干细胞介导法 （ES细胞法）
编辑pห้องสมุดไป่ตู้t
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关于ES细胞
1、胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有 高度更新能力和多向分化能力但尚未分 化的干细胞，称胚胎干细胞。
1980年，Gordon等首次采用受精卵原
核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40
的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作
转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪
元。
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4
1982年 Palmiter-“超级巨 鼠”
华盛顿大学的Palmiter将大鼠 的生长激素基因注射到小鼠受精 卵内, 培育出体型明显大于正常 小鼠的超级鼠, 成果轰动一时。
三十年来，转基因动物经历了 兴起——高潮——现在相对平稳的过程。
其重要意义在于人为实现动物物种之间， 甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的 交换与重组。
如： 改变动物性状 导入抗病基因
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二、转基因动物的概念
转基因动物（Transgenic animal） 指染色体基因组中整合有外源基 并能稳定遗传给后代的一类动物
1987年 世界上第一只商业化转基因
绵羊诞生(Roslin研究所)
1989年 精子载体法应用于转基因动物 1997年 转基因克隆动物(Roslin研究所)
转基因克隆羊Polly:携带有人凝血
因子Ⅸ
1999年 上海遗传研究所宣布转基因试
管牛“滔滔”诞生
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三十几年里，转基因动物技术飞速 发展，转基因兔、转基因猪、转基 因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续 育成。转基因动物技术已广泛应用 于生物学、医学、药学、畜牧学等 研究领域
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原理
1、逆转录病毒具有高效感染和在宿 主细胞DNA上高度整合的特性。
2、逆转录病毒能作为目的基因载体， 通过感染早期胚胎细胞实现基因转 移，产生嵌合体动物，再经过杂交、 筛选即可获得转基因动物。
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关键步骤
（1）逆转录病毒载体的构建
①提取病毒DNA ②将DNA克隆载体中 ③酶切病毒结构蛋白编码区 ④将外源目的基因克隆到载体 ⑤转染细胞，测定外源基因的表达。
电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、 逆转录病毒感染等方法
③获取囊胚期胚胎
④显微操作
ES细胞注射到囊胚期胚胎内
⑤胚胎移植
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5
转基因小鼠A生长速度要比普通 小鼠B的生长速度平均快50%。
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6
1982年 Palmiter “超级巨鼠”
重组质粒 大鼠生长激素基因置于小
鼠金属巯基蛋白启动子之后 显微注射
Plonucleus（雄原核）
卵移植
小鼠子宫
SOUTHERN 杂交检测
超级巨鼠
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7
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8
转基因动物及克隆动物 Transgenic Animal and Clonal Animal
广东药学院实验动物中心
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1
内容
转基因动物
概述、方法、应用
克隆动物
体细胞克隆
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2
第一部分 转基因动物
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3
一、研究概况
1974年Jaenisch等用病毒SV40转化的 小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宫内，在 小鼠的后代中检测到SV40基因的存在， 进行转基因技术尝试，这是最早有关动 物转基因的报道。