转基因动物及克隆动物

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（2）包装细胞
决定着重组病毒效价及其宿主范围。 常用φ-2细胞株
（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎
载体转染包装细胞后与8细胞胚胎 共培养进行转染
（4）胚胎移植 （5）建系
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（三）胚胎干细胞介导法 （ES细胞法）
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关于ES细胞
1、胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有 高度更新能力和多向分化能力但尚未分 化的干细胞，称胚胎干细胞。
三十年来，转基因动物经历了 兴起——高潮——现在相对平稳的过程。
其重要意义在于人为实现动物物种之间， 甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的 交换与重组。
如： 改变动物性状 导入抗病基因
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二、转基因动物的概念
转基因动物（Transgenic animal） 指染色体基因组中整合有外源基 并能稳定遗传给后代的一类动物
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原理
1、逆转录病毒具有高效感染和在宿 主细胞DNA上高度整合的特性。
2、逆转录病毒能作为目的基因载体， 通过感染早期胚胎细胞实现基因转 移，产生嵌合体动物，再经过杂交、 筛选即可获得转基因动物。
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关键步骤
（1）逆转录病毒载体的构建
①提取病毒DNA ②将DNA克隆载体中 ③酶切病毒结构蛋白编码区 ④将外源目的基因克隆到载体 ⑤转染细胞，测定外源基因的表达。
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（二）逆转录病毒法
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关于逆转录病毒
1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病 毒类的总称。
2. 2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作 用下可以将本身的单链RNA作为模板进
行复制和遗传信息的传递。
3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主 细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。
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转基因鼠
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5只克隆出的转基因小猪 Noel、Angel、Star、Joy和Mary。
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全球首只转基因猴“Andy”
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转基因鱼
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转基因试管牛“滔滔”
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英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图
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嵌合体动物（Chimeric animal）
部分组织细胞中整合有外源基因 组的动物
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三、转基因动物培育原理
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四、方 法
➢ 显微注射法 ➢ 逆转录病毒法 ➢ ES（胚胎干细胞）法
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➢ 精子载体法
➢ 脂质体载体法 ➢ 电脉冲法 ➢ 基因枪法 ➢ 体细胞核移植技术（转基因克隆技术）
1987年 世界上第一只商业化转基因
绵羊诞生(Roslin研究所)
1989年 精子载体法应用于转基因动物 1997年 转基因克隆动物(Roslin研究所)
转基因克隆羊Polly:携带有人凝血
因子Ⅸ
1999年 上海遗传研究所宣布转基因试
管牛“滔滔”诞生
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三十几年里，转基因动物技术飞速 发展，转基因兔、转基因猪、转基 因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续 育成。转基因动物技术已广泛应用 于生物学、医学、药学、畜牧学等 研究领域
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显微注射仪
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体视镜
煅针仪
拉针仪 编辑ppt
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（2） 受精卵的采集
供体鼠超排：
PMSG,ip HCG,ip 48hr
输卵管膨大部受精卵的采集
受精卵消化、洗涤、培养
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受精卵的采集
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受精卵的消化、培养
消化、洗涤后受精卵
原核清晰的受精卵
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（一）显微注射法
（以培育转基因小鼠为例）
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1.方法
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显微注射制作转基因动物流程图
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2.具体步骤
（1）前期准备
实验动物：供体鼠 、 受体鼠 、结扎雄鼠
仪器设备：拉针仪 、煅针仪、体视镜、显微注射仪
实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、 透
明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、 M16 、注射用矿物油、注射针、持卵针
电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、 逆转录病毒感染等方法
③获取囊胚期胚胎
④显微操作
ES细胞注射到囊胚期胚胎内
⑤胚胎移植
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（3） 受精卵的显微注射
注射前
中注 射
注射后
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（4） 受精卵的移植
受体假孕鼠的制备：
母鼠与结扎公鼠合笼（与供体鼠同步）
假孕鼠的挑选
注射后收集卵的移植
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受精卵的移植
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（5） 得到founder转基因小鼠
（6） 对founder转基因小鼠进 行鉴定、筛选、杂交获得纯合转 基因小鼠
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转基因小鼠A生长速度要比普通 小鼠B的生长速度平均快50%。
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1982年 Palmiter “超级巨鼠”
重组质粒 大鼠生长激素基因置于小
鼠金属巯基蛋白启动子之后 显微注射
PBiblioteka Baiduonucleus（雄原核）
卵移植
小鼠子宫
SOUTHERN 杂交检测
超级巨鼠
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2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎 后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括 生殖细胞在内的所有组织。
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原理
将外源目的基因导入ES细胞，再移入 胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎 移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由 胚胎干细胞介导的转基因动物。
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关键步骤
①ES细胞的分离培养
②ES细胞基因操作
转基因动物及克隆动物 Transgenic Animal and Clonal Animal
广东药学院实验动物中心
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内容
转基因动物
概述、方法、应用
克隆动物
体细胞克隆
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第一部分 转基因动物
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一、研究概况
1974年Jaenisch等用病毒SV40转化的 小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宫内，在 小鼠的后代中检测到SV40基因的存在， 进行转基因技术尝试，这是最早有关动 物转基因的报道。
1980年，Gordon等首次采用受精卵原
核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40
的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作
转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪
元。
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1982年 Palmiter-“超级巨 鼠”
华盛顿大学的Palmiter将大鼠 的生长激素基因注射到小鼠受精 卵内, 培育出体型明显大于正常 小鼠的超级鼠, 成果轰动一时。