溶血空斑实验_PPT幻灯片

●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B 细胞 ），空斑的数量反映机体的体液免 疫功能。
●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的 多少。由于溶血空斑试验具有特异性高， 筛选力强，可直接观察等优点，故可用 做判定免疫功能的指标，观察免疫应答 的动力学变化，并可进行抗体种类及亚 类的研究。
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ）
注意事项
⒈ 对SRBC的要求：因为SRBC既是免疫原，也 是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜， 洗涤不超过3次，每次2 000r/min离心5min， 细胞变形或脆性增大者均不能使用。
2．免疫所用SRBC的数量：尾静脉注射以 2.00×104 个/0.2ml为宜。腹腔注射为 4.00×108 个 /ml，用量小，如低于1.00×107个 /ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超 过2.50×109个/ml，不能形成空斑。
实验目的
• 掌握溶血空斑试验检测原理 • 掌握溶血空斑的操作方法
实验原理
●溶血空斑实验（plaque forming cell assay,PFC ） 体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一 种方法。
●其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小 鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液， 与一定量的SRBC结合，在37℃条件下免疫活性 淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶 解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞 周围形成一个可见的溶血空斑。
6．补体的活力：补体活力的大小，对溶 血空斑的形成关系很大。如出现抗体或 补体的活力低下，将不能形成空斑。所 以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清 混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了 活化补体。
7．空斑计数：要求判读准确，避免辨认 造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检， 对肉眼结果进行核对。
• 所以器皿和各种试剂在加入表层基前均 需预温。
③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）： 将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7% 两种浓度。将表层基分装于小试管中， 每管2ml
④补体：新鲜豚鼠血清
⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备
①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬 液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。
3．采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹 腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或 过晚空斑都形成极少。
4．脾细胞的活力： 为了保证脾细胞的活力，制 备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液）， 最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操来自百度文库 过程应在冰浴中进行。
5．倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好 温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。
• SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须 准确。
• 免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个 体差异大，难以比较，最好先作几次预 实验，使每个玻片空斑数控制在100200个为宜。
思考题
• 溶血空斑实验的意义？
（四）加补体
• 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰 箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处，用 肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的 溶血状况，并记录整个平皿中的空 斑数，同时求出每百万个脾细胞内 含空斑形成细胞的平均数。
（二）倾注底层琼脂
• 将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于 水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固 后，用前置55℃水浴锅中预温。
（三）表层琼脂的制备
• 将0.7%的琼脂融化后，置于55℃恒 温水浴箱中，依次加入以下试剂：
• ⑴ 20%SRBC悬液0.1ml。
• ⑵ 小牛血清0.1ml。
• ⑶ 5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。 迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂 的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静 置约15min，放37℃温育2h。
②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小 鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的 PBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS， 用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管 中，2500r/min离心5min，弃上清后，定量 加入PBS液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍 （浓度约为5×106个/ml）