高美华《医学免疫学》补体结合实验

五、实验报告
掌握实验原理，记录并分析实验结果。
溶血空斑形成实验（Plaque Forming test，PFT）——小室液相法
一、原理
小鼠溶血空斑形成试验：取用绵羊红细胞 （SRBC）免疫过的小鼠脾细胞悬液，与 SRBC和补体混合，灌入用玻片制备的透明小 室中，孵育后脾细胞可产生抗SRBC抗体与其 周围的SRBC结合，在补体的作用下，即可溶 解SRBC而形成透明溶血区。 检测实验动物抗体生成细胞产生IgM的能力。
二、器材与试剂 1、拨片、双面胶 2、细胞培养板、细胞筛等 3、SRBC、豚鼠血清（补体）
三、方法
1、免疫小鼠 2、制备脾细胞悬液 3、制备10%SRBC 4、补体制备 5、制备液相小室 6、正式实验 按讲义混合小室液，用毛细滴管灌入小室，灌满
为止，用石蜡封边，37 ℃孵育1.5小时。
四、结果判断
2
0.02 0.28
0.1
置 0.2
37
3
0.03 0.27
0.1
℃ 0.2
4 0.04 0.26 0.1 水 0.2
5
0.05 0ห้องสมุดไป่ตู้25
0.1
浴 0.2
10
6
0.06 0.24
0.1
mi 0.2
n
7 0.08 0.22 0.1
0.2
放 不溶血
置 不溶血
37 ℃
不溶血
水 微溶血
浴 微溶血
30 min
四、结果判断：
根据最接近50%溶血管的管号，查出该管所加待 检血清标本量，按下列公式计算：
CH50（U/ml）=1/ 50%溶血管的血清用量（ml） ×稀释倍数
正常范围：50~100 U/ml
补体结合试验 （complement fixation test，CFT）
一、原理
Ag和相应Ab反应所形成的免疫复合物（IC）能吸 附（固定）并激活补体。5种成份分属于：⑴反应系统； ⑵补体系统；⑶指示系统。
二、试剂
1、绵羊红细胞（SRBC）：无菌采静脉血，除去纤维蛋 白后，洗涤配成2%浓度应用。
2、溶血素：抗绵羊红细胞抗体，需提纯后灭活补体。用 稀释缓冲液稀释至2单位。
3、稀释缓冲液： PH7.4巴比妥缓冲液
三、方法
1、待检标本的处理：
取试管一支加待测血清0.20ml，加入3.80ml pH7.4巴 比妥缓冲液，使血清为1：20稀释。
2、取1列10支试管，从1~10编号，第1~9为测定管，第 10管为对照管。按表进行加样。
3、50%溶血标准管
全溶管：2%SRBC 1ml+4ml蒸馏水混匀静置10min
50%溶血管：2ml全溶管液体+2ml pH7.4巴比妥缓冲 液。
4、上述所有试管经2500rpm，离心5min后，与50%溶 血管肉眼初步比较，取较接近的2管进行比色，确定 最接近50%溶血管的管号。
用肉眼计数小室的空斑数。 计算20μl脾细胞所形成的空斑数，设为X1。 则；250：300=计数小室空斑数：X1 再计算全脾细胞所形成的空斑数，设为X2。 则：20：6000=X1：X2 空斑形成率=全脾细胞所形成的空斑数/全脾的脾细胞数
X100%
8 1:1600│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │分│微溶
9 1:2000│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │钟│微溶
10 1:2400│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
11 1:3200│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
──── ┼───┼─── ┼────┼─── ┼────
1 1:300 │ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │放│全溶
2 1:400 │ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │置│全溶
3 1:500 │ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ 37│全溶
按照下表操作
以能产生完全溶血的最少量的补体为1个“恰定 单位”，全溶第2管为1个“实用单位”。正式 试验时使用2个实用单位。
补体效价滴定
1:60 pH 7.4巴 稀释抗 管 补体 比妥缓 原(ml) 号 (ml) 冲液(ml) 注①
1%致敏羊 红细胞(ml) 注②
假定结果
1 0.01 0.29 0.1 放 0.2
12 1:4000│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
13 1:4800│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
14 1:6400│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
2、补体滴定：一般用豚鼠补体，每次试验前均 应滴定
补体结合试验图示
受检系统
指示系统
溶血反应
1、仅有抗原或抗体
红
细
补
胞
抗原/抗体
体
溶血素
阳性
2、抗原抗体反应
抗原 补 体
抗体
红细胞 溶血素
阴性
补体结合试验 阴性
阳性
二、试剂
1、受检抗原、抗血清（56℃ 30min灭活， 1:50稀释）。
2、补体（豚鼠新鲜血清，2u）、1%绵羊红细 胞（SRBC）、溶血素（2u）。
4、补体结合正式试验 按照讲义的表操作
应作抗原或血清对照管，SRBC、溶血素 对照管。
四、结果观察
1、管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内 液体透明呈红色为溶血。
2、第2、3、4管为对照管均应溶血，第5 管为绵羊红细胞对照不应溶血。凡第1管 红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性， 而不溶血者为阳性。
全溶（1个恰定 单位）
全溶（1个实用 单位）
8 0.10 0.20 0.1
0.2
全溶
9 0.12 0.18 0.1
0.2
全溶
10 0.15 0.15 0.1
0.2
全溶
注①:
为了排除抗原或抗体的抗补体作用，需在补体滴定的 同时加入抗原或抗体（如待检系统中以抗原测定未知 抗体，需加入抗原，反之则加抗体）。
50%溶血试验（ 50% complement hemolysis, CH50）测定血清总补体
活性
一、实验原理
补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性 抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血，溶血 程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂 量依赖呈一特殊的S形曲线，该曲线在 30%~70%之间最陡，几乎呈直线，即此阶段 对补体量的变化非常敏感，因此实验常以50% 溶血作为判断终点来测定血清总补体活性，这 一方法称为补体50%溶血实验（ CH50 ）。
注②:
指稀释好的每2单位溶血素与等量2％绵羊红细胞悬液 混合，置室温作用20～30分钟即可。
效价计算：从上表可以看出：0.06ml 1:60稀释的补体为1 个“恰定单位”，0.08ml为1个“实用单位”。补体结 合试验用2个“实用单位”，则0.16ml 1:60稀释补体相 当于2个“实用单位”。由于正式试验时所加入的补体 量为0.2ml， 因此需按下公式算出所用补体的稀释倍数。
3、生理盐水、试管、吸管、水浴箱等。
三、方法 1、溶血素效价的滴定 按照下表操作 以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效 价。 在补体结合试验时，溶血素的效价也称之为1个 溶血素单位，在正式试验时一般采用2个溶血素 单位。
管 溶血素│
│ 2 单位 │ pH 7.4巴│ 2％羊 │
号 稀释度│溶血素│补 体 │比妥缓冲│红细胞│假定结果
4 1:600 │ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │℃│全溶
5 1:800 │ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │水│全溶
6 1:1000│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │浴│全溶
7 1:1200│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │30│全溶
0.08×2 ：60＝0.2 ：X
60×0.2
X＝─────＝75
0.08×2
即将豚鼠血清用pH 7.4巴比妥缓冲液作1:75稀释后，每 0.2ml中含2个实用单位的补体。
3、抗原和抗体的滴定：
一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强 阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价 （或单位）。正式试验时，抗原一般用2~4个 单位，抗体采用4个单位。
反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应 系统，优先结合补体。若反应系统中待测的Ab（或 Ag）与已知Ag（或Ab）相对应，则Ag与Ab形成IC后 可结合补体；再加入指示系统时，因已没有游离的补 体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。若不相对应， 将会有游离的补体参与指示系统的反应，最终会出现 溶血现象，为阴性。