补体结合试验

第二节补体结合试验

补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。

一、类型及原理

该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。

图14-2补体结合试验示意图

二、试验方法

补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。

（一）试剂

1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓

度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用2～4个单位（1:64～1:32），抗体采用4个单位（1:8）。

表14-4抗原和抗体的方阵滴定

抗原抗血清稀释倍数抗原

对照1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512

1:4 4 4 4 4 4 4 3 2 0

1:8 4 4 4 4 4 3 2 1 0

1:16 4 4 4 4 3 2 2 ±0

1:32 4 4 4 4 3 1 ±0 0

1:64 4 4 4 ④ 2 ±0 0 0

1:128 4 2 1 0 0 0 0 0 0

1:256 3 1 0 0 0 0 0 0 0

1:512 0 0 0 0 0 0 0 0 0

抗体对照0 0 0 0 0 0 0 0

注：1、2、3、4分别表示溶血反应强度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0为不溶血。

3．补体滴定按表14-5逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:x计算，x＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。

表14-5补体的滴定

管号1:60补体（ml）缓冲液（ml）稀释抗原（ml）致敏srbc

（ml）

结果

1 0.04 0.26 0.1 放

置0.2 放

置

不溶血

2 0.06 0.24 0.1 0.2 不溶血

3 0.08 0.22 0.1 0.2 微溶血

4 0.10 0.20 0.1 0.2 微溶血

5 0.12 0.18 0.1 37℃水

浴30min 0.2 37℃水

浴30min

全溶血

6 0.14 0.16 0.1 0.2 全溶血

（二）血清标本

采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于－20℃。血清在试验前应先加热56℃30min （或60℃3min）以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：①加热提高12；②－20℃冻融后离心去沉淀；③以3mmol/l盐酸处理；④加入少量补体后再加热灭活；

⑤以白陶土处理；⑥通入co2；⑦以小白鼠肝粉处理；⑧用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。（三）正式试验

以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2u为全溶，1u为全溶略带有少许红细胞，0.5u应不溶。如0.5u补体对照出现全溶表明补体用量过多；如2u对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。

表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序

反应物（ml）待检血清管阳性对照管阴性对照管抗原对

照管补体对照管红细胞对照管

测定对照测定对照测定对照2u 1u 0.5u

稀释血清0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 －－－－－抗原0.1 －0.1 －0.1 －0.1 0.1 0.1 0.1 －缓冲液－0.1 －0.1 －0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.4 2u补体0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 －－－

1u补体－－－－－－－－0.2 －－0.5u补体－－－－－－－－－0.2 －混匀，置37℃1h或4℃16～18h

致敏红

细胞

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀，置37℃30min后观察结果