实验3 抗体制备 补体结合 PBMC分离

…… 0.2mL
摇匀，37℃，水浴15min
预期结果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透 明呈红色为溶血。
2.
试验管
？
溶血 不溶血
血清对照管 抗原对照管 补体对照管 SRBC对照管
溶血
溶血
溶血
不溶血
注意事项：
• 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧 烈震荡。
• 各种试剂的吸管不可混用。
Test 2 人外周血单个核细胞分离
2000rpm，离心20min
小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
细Baidu Nhomakorabea计数
WBC
1mm WBC 1mm
WBC
WBC
Cell concentration/ml = Total cell count in 4 squares /4 x 104
0.2mL 0.2mL
……
0.2mL … …
0.2mL
0.2mL 0.2mL
0.2mL
……
0.2mL
0.2mL
摇匀，37℃，水浴15min
…… …… 0.2mL 0.4mL
…… …… …… 0.8mL
溶血素 SRBC
0.2mL 0.2mL
0.2mL 0.2mL
0.2mL 0.2mL
0.2mL 0.2mL
Ag + Ab
Binding to Complement
Ag + Ab + C
Activation of Complement
Lysis of target cells
概念：
补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（
SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示 系统的抗原抗体反应。
原理：
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)
正常范围:60-80%
X 100%
淋巴细胞增殖实验
外周血或分离 PHA 涂片染色
的淋巴细胞
共培养
形态学观察 计算转化率
Test 3 抗体制备
方法:
脱纤维绵羊红细胞（SRBC） 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min
1
2
Step 3 SRBC的裂解
Ab 阳性
Ag
Ag
待测血清
No Ab 阴性
Ag Ag
材料：
✓ 抗原：伤寒菌裂解产物 ✓ 待测血清：56℃，30min ✓ 补体：豚鼠血清 ✓ 2%绵羊红细胞 ✓ 溶血素
方法： 试验管
1
（1份/2人）
血清 对照管
2
抗原 对照管
3
补体 对照管
4
SRBC 对照管
5
待测血清 抗原 补体 N.S
弃上清 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min
弃上清
制备绵羊红细胞溶液30%、 35%、40%、50%
取0.1ml 皮下注射 免疫小鼠
补反中包括两个系统五种成分：
✓ 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及 仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。
✓ 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。
1：No Ab； 2：Ab
待测系统 抗原+未知血清
补体
指示系统 SRBC+抗SRBC抗体
1
2
12
Step 1
Step 2
抗原抗体复合物的形成 补体的结合和耗竭
实验原理：
1.密度梯度离心法
淋巴细胞分离液
外周血
离心
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
血浆层
淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
分离液 (1.077±0.002g/l)
粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，沿试管壁缓慢加入到2ml分 离液中
实验三 1.补体结合反应 2.人外周血单个核细胞分离 3.抗体制备(3)
Test 1 补体结合反应 （Complement fixation Test, CFT）
补体结合位点
结合抗原之前
结合抗原之后
Fc段
CH1
C1q 结合
CH2
位点被屏
障
IgM CH3区，IgG CH2区
暴露的 C1q结 合位点
RBC
Cell concentration/ml = Total cell count in 5 squares x 5 x 104
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活. • 应用水平离心机.
SRBC CD2
E-花环形成实验
T
B
• 用于检测外周血T细胞的数量和比例.