补体结合

1．绵羊红细胞悬浮液的制备通常用公绵羊红细胞，将绵羊血液采集于带有玻璃珠的无菌容器中，充分振摇，使脱去纤维，此时血液失去凝固性，称脱纤血。
亦可用阿氏液保存血液，阿氏液配方如下：
葡萄糖24.60g
氯化钠5.04g
柠檬酸钠（含2个分子结晶水）9.60g
蒸馏水1 200ml
溶液配好后，高压（10磅）灭菌10min，也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶内，将绵羊血直接采入瓶内，血量应大致与阿氏液量相等。摇匀，置冰箱中保存，可保存3周左右。
由于许多抗原是非细胞性的，而且上述抗原、抗体和补体三种成分都是用生理盐水或缓冲盐水稀释的比较透明的液体，所以补体不论是否被结合，都不能直接看到，故无法判定。
因此，在反应系统的三种成分作用一定时间之后，再向其中添加指示系统—绵羊红细胞和特异性抗体溶血素。如果抗原和病马血清中抗体特异性结合，吸附补体，没有游离补体存在，加入指示系统，因无补体参加，不发生溶血，这种情况称为补体结合反应阳性，即该马患有鼻疽病；反之，则该马未患鼻疽病。
0
0
0
0
0
10
30
30
500
1:25
0
0
0
0
0
20
40
40
100
1:50
10
0
0
0
10
30
50
50
100
1:75
50
20
10
0
20
50
70
70
100
1:100
80
80
70
60
90
100
100
100
100
表注：表中0～100均为溶血的百分比
表6-7是一份强阳性血清测定结果的一个示例。按比例，抗原1︰100稀释液与强阳性血清的各稀释度所发生的抑制溶血现象最强。如果对弱阳性血清的各稀释液的反应亦与此相同，则此批抗原的效价为1︰100，这就是一个抗原工作量。应注意，测定抗原必须用病马阳性血清，不可使用注射鼻疽死菌免疫的兔高免血清。
血清采后最好于1天内送到实验室，最迟不超过3天。若3天内不能送到，应加防腐剂。通常加0.50％石炭酸防腐。试验前，用生理盐水将待检血清稀释10倍，然后在水浴槽内加温灭能30min，马血清加温到60℃。驴、骡血清为63℃～64℃。灭能不但能消除血清中的补体和抗补体作用，且能使它在反应中作用趋于稳定。
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴20min
致敏血
球（ml）
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00 1.00
37℃水浴20min
抗原效价测定的结果根据溶血百分数来判定
表6-7 抗原效价测定结果示例
抗原稀释
10
50
75
100
150
200
300
400
500
阳性血清
1:10
第十一节补体结合反应技术
（Complement fixation reaction technique）
一、概况
可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。
补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。
反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血清（抗体）和豚鼠血清（补体），这三种成分称为反应系统或溶菌系统。如果该马是鼻疽病马，则血清中有抗鼻疽杆菌的抗体。抗原和抗体发生结合，吸附补体。如果该马没有鼻疽病，血清中没有抗鼻疽菌的抗体，则不能形成抗原抗体复合物，不能吸附补体，则补体游离存在。
表6-4 抗原稀释表
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
稀释倍数
10
50
75
100
150
200
300
400
500
生理盐水（ml）
抗原（ml）
实存量（ml）
6.50
5.00
7.50
6.50
4.50
4.00
4.50
4.00
5.00
⑵血清稀释：取鼻疽强阳性血清和弱阳性血清各一份，用生理盐水按表6-5做成5种稀释液，在60℃水浴中灭能30min。
表6-2 溶血素效价测定示例
稀释
倍数
1 000
1 200
1 500
1 800
2 000
2 500
3 000
3 500
4 000
溶血素对照
补体
对照
血球
对照
溶血素
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
生理
盐水
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。
（二）溶血反应
将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血
（五）补体结合反应的应用
补体结合反应是诊断人、畜传染病常用的血清学诊断方法之一。本法不仅可用于诊断传染病，如鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、血锥虫病等，也可用于鉴定病原体，如对马流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。
二、经典补体结合反应（以马鼻疽补反为例）
（一）预备试验
测定和使用补体时，按表6-3进行。
表6-3补体效价测定表
试管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
对照
1︰20补体
0.10
0.13
0.16
0.19
0.22
0.25
0.28
0.31
0.34
0.37
0.40
—
生理盐水
0.90
0.87
0.84
0.81
0.78
0.75
0.72
0.69
0.66
0.63
0.60
1.00
一个工作量抗原
用时将血液移入离心管内，加3～5倍量生理盐水，离心沉淀洗涤三次，每次2 000r／min，离心10min，然后去掉上清液，血球泥用生理盐水配成2.50％液应用。
2．溶血素效价测定溶血素是用绵羊红细胞，经多次免疫家兔，抽取家兔血清，加入甘油而成。在冰箱中可保存二年以上。每隔两、三个月测定效价一次。溶血素可从生物制品厂购买。
溶血素效价测定的方法：先将溶血素稀释成100倍，即0.20ml的溶血素（溶血素实量含0.10ml）加入9.80ml生理盐水混合即可。然后按表6—1配成稀释液：
表6-1溶血素稀释表
稀释倍数
1 000
1 200
1 500
1 800
2 000
2 500
3 000
3 500
4 000
1︰100溶血素
生理盐水
3．补体的效价测定取健康豚鼠3只以上，饲喂前，每只从心脏取血8ml～15ml，注入培养皿内，放入37℃温箱内30min，取出置4℃冰箱内，待血清析出后，吸入离心管中，3 000r／min离心15min，取上清趁新鲜稀释使用。如一次采取大量补体，可定量（1ml～2ml）分装于青霉素瓶内，置低温冰箱冻结保存。避免反复冻融。也可从兽药厂购买冻干补体，在冰箱内可保存三年。
在2单位溶血素的存在下，能使0.50ml的2.50％红细胞完全溶血的最小补体量，即为该补体的效价。在本例中，补体效价为1:20稀释液0.25ml。
效价测完后，按下列计算原补体在使用时应稀释的倍数。
0.50／0.25×20.0＝40.00
即此补体应作1︰40稀释使用，每管加入0.50ml，此即为1个单位补体。考虑到补体性质不稳定，在操作过程中效价会降低，故此使用浓度比原效价大10.00％左右较为适宜。因此，本批补体应用1︰36稀释使用，每管加入0.50ml。
表6-5 鼻疽阳性血清稀释表
稀释倍数
10
25
50
75
100
生理盐水(ml)
9.00
9.60
9.80
7.40
9.90
血清（ml）
1.00
0.40
0.20
0.10
0.10
⑶操作法：按表6-6进行。摆12排反应管，由左向右加入不同稀释度的抗原0.50ml。然后再由上向下，第一排的9个试管各加入1∶10灭能的阴性马血清0.50ml。第二排的9个试管各加入生理盐水0.50ml。第三排至第七排试管分别加入不同稀释度的强阳性血清0.50ml。第八排到第十三排再分别加入不同的稀释度弱阳性血清0.50ml。所有试管加入一个单位补体0.50ml，混匀后置37℃水浴箱20min取出，每管加致敏血球1.00ml，摇匀后，置37℃水浴20min，取出，观察反应结果。
补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet和Gengou在1901年设计这一试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。
（一）补体及其作用特点
补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min可使补体失去活性，称为“灭能”或“非动”。
全量
0.10
0.90
1.00
0.10
1.10
1.20
0.10
1.40
1.50
0.10
1.70
1.80
0.10
1.90
2.00
0.10
2.40
2.50
0.10
2.90
3.00
0.10
3.40
3.50
0.10
3.90
4.00
另取小反应管一列，按次序从每一稀释液取0.50ml分别加入各管中，添加时应由稀释度大的稀释液加起，这样可不必更换吸管。然后再加入生理盐水1.00ml，1︰20补体和2.50％红细胞悬液各0.50ml。在37℃水浴槽中放20min后判定结果。详细操作程序见表6-2。
表6-6 抗原效价测定表
抗原稀
释倍数
10
50
75
100
150
200
300
400
500
抗原(ml)
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.5
稀释血清（ml）
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
补体（ml）
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
4．抗原效价测定鼻疽补体结合反应抗原是用强毒鼻疽杆菌的混悬液，经高压灭菌，并在冷处浸泡取其滤液制成的。鼻疽抗原可向兽药厂购买。使用时按出厂使用说明书或标签标明的效价稀释应用。如因保存时间过久或其它原因，抗原效价可能发生变化，使用前加以滴定。
⑴抗原稀释：用生理盐水将抗原原液作成9种稀释液，方法如表6-4。
5．待检血清和对照血清对照用鼻疽阳、阴性血清可于兽医生物制品厂购买，也可自送检血清中选取。
待检血清采血时，最好在早饲前或在停食后6h，以免血清混浊。采血后，趁血未凝固，将试管斜置，使其凝成斜面。凝固后将试管置于温暖处，使血清析出，经过10余小时，将血清倾入另一干净无菌试管中。如血清析出不良时，可用镍线将血凝块划破，并使之从管壁脱离，放于冷暗处，使血清充分析出。
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴20min
致敏血球
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
结果
部分溶血
全部溶血
不溶
补体效价测完后，按表添加各种成分。所用的致敏血球是将2单位溶血素和2.50％红细胞液等量混合后，置37℃水浴中15min，即成为致敏血球。
(四)补体结合反应的特点
补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的比例。特别是补体和溶血素的用量。补体的用量必须恰如其分，例如：抗原抗体呈特异性结合，吸附补体，本应不溶血，但因补体过多，多余部分转向溶血系统，发生溶血现象。又如抗原抗体为非特异性，抗原抗体不结合，不吸附补体，补体转向溶血系统，应完全溶血，但由于补体过少，不能全溶，影响结果判定。故补体量必须恰如其分。溶血素量也有一定影响，例如阴性血清，应完全溶血，但溶血素量少，溶血不全，可被误认为弱阳性。另外，这些因子的用量又与其活性有关：活性强，用量少；活性弱，用量多，故在本试验之前，必须精确测定溶血素效价、溶血系统补体价、溶菌系统补体价等，测定其活性以确定用量。
素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体游离存在的指示剂。
（三）补体结合反应及其原理
可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原和抗体。此反应即为补体结合反应。
1.00
1.00
1.50
1.50
2.00
1:20
补体
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
—
0.50
—
2.50％红细胞
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴20min
结果
全部溶血
部分溶血
不溶血
试验中发生全部溶血的溶血素最大稀释倍数（即1︰2 000），微溶血素的效价，亦称一个溶血单位。做正式试验时，溶血素按二个单位稀释使用。在本例中，其使用浓度应为1︰1 000。