医学免疫学：溶血空斑试验(PFC测定)
临床免疫学检验 名词解释整理
抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。
抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。
亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。
抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。
带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。
在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。
抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。
免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。
当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。
载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。
载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。
单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。
多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。
抗体空斑实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体空斑实验的原理和方法。
2. 了解抗体形成细胞（B淋巴细胞）的功能和特性。
3. 通过抗体空斑实验检测和分析抗体生成细胞的功能。
二、实验原理抗体空斑实验（Plaque Formation Cell Assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，然后提取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液。
将细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，抗体形成细胞会释放出溶血素，导致周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量和大小可以反映抗体生成细胞的功能和特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 家兔或小鼠- 绵羊红细胞（SRBC）- 家兔淋巴结或小鼠脾细胞- 平皿、离心机、显微镜、温箱、水浴箱等2. 试剂：- Hanks液（含Ca2+、Mg2+）- PBS（含Ca2+、Mg2+）- 底层琼脂（1.4%）- 表层琼脂（0.7%）- 补体（新鲜豚鼠血清）- 小牛血清（56℃灭活30min）四、实验步骤1. 免疫动物：将绵羊红细胞免疫家兔或小鼠，使其产生抗体。
2. 制备细胞悬液：取出家兔淋巴结或小鼠脾细胞，制成细胞悬液。
3. 准备琼脂平板：将底层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。
4. 混合细胞悬液：将细胞悬液与SRBC混合，加入适量的补体。
5. 倒平板：将混合液倒入平皿中的底层琼脂上，待凝固。
6. 覆盖表层琼脂：将表层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。
7. 温育：将平皿放入温箱中，37℃温育24-48小时。
8. 观察：用显微镜观察溶血空斑的形成情况。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 观察到平皿中形成了多个溶血空斑，每个空斑大小不一。
- 空斑数量较多，说明抗体生成细胞的功能较强。
2. 结果分析：- 溶血空斑的形成表明实验动物产生了抗体。
- 空斑数量和大小反映了抗体生成细胞的功能和特性。
溶血空斑实验报告
一、实验目的1. 掌握溶血空斑实验的基本原理和方法。
2. 了解溶血空斑实验在免疫学中的应用。
3. 检测实验动物抗体形成细胞的功能。
二、实验原理溶血空斑实验（Plaque Forming Cell assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中。
其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑。
一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
三、实验材料与试剂1. 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜、移液器、吸管等。
2. 试剂：（1）SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.0×10^9个/mL。
（2）Hanks液（含Ca2+、Mg2+）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。
（3）底层基：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%浓度。
（4）表层基：将琼脂糖用Hanks液配成0.7%浓度。
（5）补体：新鲜豚鼠血清或小牛血清，56℃灭活30min。
四、实验方法1. 免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫：取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射1ml SRBC悬液，免疫3次，每次间隔2周。
（2）脾细胞悬液的制备：无菌取小鼠脾脏，剪碎，用生理盐水洗涤，加入适量生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10^6个/mL。
2. 溶血空斑实验（1）将底层基加入平皿中，置于37℃水浴箱中溶化。
（2）取适量脾细胞悬液加入底层基中，轻轻混匀。
（3）加入适量表层基，轻轻混匀。
（4）加入适量补体，轻轻混匀。
（5）将平皿置于37℃水浴箱中孵育4h。
PFC法玻片小室测IgM
原理： 溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞（B 淋巴细胞）的一种方法，即将经绵羊红 细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的 SRBC 结合，于 37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的 SRBC 溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一 个抗体形成细胞， 空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。 由于溶血空斑试验具有特异 性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力 学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。 悬液的制备将 16 只 BALB/c 小鼠随机分为两组， 实验组 8 只小鼠， 灌胃给药 5000mg/kg， 每日一次。 对照组小鼠 8 只， 依同法喂等量自来水。 连续 8 天实验， 前 4 天， 以 5%新鲜 SRBC 生理盐水悬液 0.4ml 免疫 16 只小鼠， 第 8 天将小鼠处死取脾制成悬液备用。 将 15%的 SRBC 悬液 50µl、1：5 稀释的补体 50µl、1× 106 个/毫升小鼠脾细胞悬液 20µl 和 Hank’s 液 180µl 混匀后，灌注于小室内。37℃ 1.5 h 后取出对着光亮处计数溶血空斑数，并计算出每 106 个 脾细胞中的空斑数。 1 绵羊红细胞（SRBC）的制备
参考文献： [1] SIMPSON M A,GOZZO J J.Spectrophotometric determination of lymphocyte
mediated sheep red blood cell hemolysis in vitro[J].Journal Of Immunological Methods,1978,21(1):159-165.
医学免疫学实验：溶血空斑形成实验
溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
溶血空斑试验PFC试验PPT课件
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、 孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上 清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶 血 空 斑 试 验 或 空 斑 形 成 细 胞 试 验 （ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物） 注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡； （2）小室边缘需用石蜡封严； （3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象 区分： 溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。 气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因
经典溶血空斑实验的原理
经典溶血空斑实验的原理在经典的溶血空斑实验中，首先需要准备红细胞悬液和抗血清。
红细胞悬液可以通过离心血液样本获得，而抗血清可以是已知含有特定抗体的人类或动物血清。
抗血清里的抗体能与红细胞上的抗原决定基结合并引起免疫反应。
实验开始前，需要配制一定浓度的抗血清稀释液。
为了确定正常血清对红细胞的影响，还需要准备一组对照试管，其中只加入红细胞悬液，不加入抗血清。
此外，还要准备一组阴性对照试管，其中既不加入抗血清，也不加入红细胞悬液。
接下来的步骤是将相应的抗血清和红细胞悬液混合。
通常，将一定量的抗血清与一定体积的红细胞悬液混合于平板或试管中。
然后，将混合物在适当条件下培养一段时间（通常为1-2小时），使抗体和红细胞发生反应。
在一定的反应时间后，观察混合物的现象。
如果抗体与红细胞上的抗原决定基结合，那么红细胞可能会发生凝聚或溶解。
凝聚通常表现为红细胞的团块状聚集，而溶解则表现为呈现空心的透明空斑。
观察结果后，可以通过显微镜直接观察试管内的现象或者使用显微镜将聚集后的红细胞和溶解后的空斑在幻灯片上涂片，然后在镜下观察。
通过对比不同试管内的结果，就可以初步判断存在的抗体种类。
如果一个特定抗体与待测的红细胞悬液混合后形成了空斑，那么可以推测该血液样本中存在该抗体。
相反，如果加入正常血清后试管中没有出现空斑或聚集现象，那么可以认为该血液样本中没有与正常抗体反应的抗体。
需要注意的是，溶血空斑实验只能初步判断抗体的存在，不能确定抗体的种类，因为不同抗体对红细胞的作用机制不同，有的抗体可以引起热凝集现象，有的可以引起冷凝集现象，而有些抗体则可以引起溶解等。
所以，在鉴定抗体种类时，还需要进行进一步的试验，如冷凝集试验、ELISA等。
在实际应用中，溶血空斑实验被广泛用于免疫学研究、血型鉴定、自身免疫性溶血性贫血的诊断等。
通过检测抗体与红细胞之间的反应，溶血空斑实验为临床诊断提供了有力的工具。
同时，该实验的原理也为研究免疫学和血液学提供了实验基础。
溶血空斑实验的原理及应用
溶血空斑实验的原理及应用1. 溶血空斑实验介绍溶血空斑实验是一种常用的实验方法，用于检测溶血素和溶血抗体对红细胞产生的溶血现象。
通过此实验可确定溶血素或溶血抗体对红细胞膜的破坏能力。
2. 溶血空斑实验的原理溶血空斑实验的原理基于溶血素或溶血抗体与红细胞的相互作用。
溶血素或溶血抗体与红细胞结合后，会导致红细胞膜破坏，形成溶血空斑。
3. 溶血空斑实验的步骤溶血空斑实验的步骤如下：•选择适当的红细胞供试验•准备适当稀释的溶血素或溶血抗体溶液•将稀释的溶液与红细胞混合，孵育一段时间•离心样品，观察沉淀•根据结果判断溶血程度4. 溶血空斑实验的应用溶血空斑实验在许多领域有广泛的应用，包括以下几个方面：4.1 血型鉴定溶血空斑实验可用于血型鉴定。
通过将不同血型的红细胞与已知抗血清进行反应，观察是否出现溶血空斑，从而确定血型。
4.2 疾病诊断溶血空斑实验可用于某些疾病的诊断，如溶血性贫血。
溶血性贫血的患者红细胞易受到溶血素的破坏，通过溶血空斑实验可以检测红细胞抵抗溶血的能力。
4.3 药物毒性测试溶血空斑实验还可用于药物毒性测试。
某些药物可能对红细胞膜产生损伤，通过溶血空斑实验可以评估药物的毒性。
4.4 免疫学研究溶血空斑实验在免疫学研究中也有重要应用。
通过溶血空斑实验可以检测抗体与红细胞间的相互作用，从而研究免疫反应机制。
5. 结论溶血空斑实验是一种常用的实验方法，可用于血型鉴定、疾病诊断、药物毒性测试以及免疫学研究等领域。
通过观察溶血空斑的形成情况，可以了解溶血素或溶血抗体对红细胞的影响，为相关领域的研究和诊断提供一定的依据。
《医学免疫学》试题库及答案(含10套试卷及答案)
《医学免疫学》试题库及答案（含10套试卷及答案）试卷（一）一、单项选择题（每小题1分，共20分）1．胸腺依赖抗原诱发抗体反应必须由以下哪一组细胞参与（）A．T淋巴细胞和B淋巴细胞B．T淋巴细胞和巨噬细胞C．T、B淋巴细胞和巨噬细胞D．B淋巴细胞和巨噬细胞E．T、B淋巴细胞和NK细胞2．抗原的特异性决定于（）A．抗原的分子量B．抗原决定簇的多少C．抗原的异物性D．抗原决定簇的性质、数目和空间构型E．抗原的免疫反应性3．宿主的天然抵抗力是（）A．感染病原微生物而获得B．经遗传而获得C．接种菌苗或疫苗而获得D．母体的抗体通过胎盘给婴儿而获得E．给宿主输入抗体或致敏淋巴细胞而获得4．关于佐剂的描述，哪一种说法是错误的（）A．佐剂是特异性免疫增强剂B．与免疫原混合后可增加抗原在体内存留时间C．最常用于试验动物的是福氏佐剂D．可刺激单核巨噬细胞，增加对抗原的处理和提呈能力E．增强辅助性T淋巴细胞的作用5．下列哪一种细胞因子是由T淋巴细胞分泌的（）A．IL1D．IL12B．IL2E．IL8C．IL36．B淋巴细胞能识别特异性抗原，其表面有（）A．Fc受体D．SmIgB．C3受体E．LPS受体C．E受体7．单向混合淋巴细胞反应试验的主要反应细胞是（）A．巨噬细胞D．自身抗原B．B淋巴细胞E．中性粒细胞C．T淋巴细胞8．人CD8抗原相当于小鼠细胞表面哪种抗原? （）A．Lyt1D．Ly1.1B．Lyt2、Lyt3E．Ly2C．Ly59．淋巴细胞归巢受体是指（）A．成熟淋巴细胞向中枢免疫器官的迁移B．淋巴细胞的一种定向迁移C．淋巴细胞随血流达到全身器官D．未成熟T淋巴细胞在胸腺内从皮质迁移到髓质E．以上均不是10．免疫自稳功能异常可发生（）A．病毒持续感染D．自身免疫病B．肿瘤E．免疫缺陷病C．超敏反应11．TH1细胞可通过下列哪种作用产生免疫效应?（）A．非特异性杀伤靶细胞B．分泌抗体C．特异性直接杀伤靶细胞D．释放细胞因子产生免疫效应E．ADCC作用12．致敏TC的作用特点是:（）A．无抗原特异性B．受MHCⅡ类分子限制C．可通过释放IFN杀伤靶细胞D．可通过ADCC作用杀伤靶细胞E．可通过分泌穿孔素、颗粒酶等物质杀伤靶细胞13．免疫应答过程不包括:（）A．B细胞在骨髓内的分化成熟B．B细胞对抗原的特异性识别C．巨噬细胞对抗原的处理和呈递D．T、B细胞的活化、增殖、分化E．效应细胞和效应分子的产生和作用14．人体受抗原刺激后发生免疫应答的部位主要是:（）A．骨髓B．胸腺C．腔上囊D．淋巴结E．血流15．抗原的免疫原性是指:（）A．抗原刺激机体免疫系统，产生抗体的性质B．抗原刺激机体免疫系统，产生致敏淋巴细胞的性质C．抗原与相应抗体在体内外特异性结合的性质D．抗原与相应致敏淋巴细胞在体内外特异性结合的性质E．抗原刺激机体免疫系统，产生抗体和(或)致敏淋巴细胞的性质16．容易引起免疫耐受的抗原注射途径为:（）A．静脉﹥皮下、肌肉﹥腹腔B．腹腔﹥皮下、肌肉﹥静脉C．腹腔﹥静脉﹥皮下、肌肉D．静脉﹥腹腔﹥皮下、肌肉E．皮下、肌肉﹥腹腔﹥静脉17．Ⅰ型超敏反应不具有的特点是:（）A．有明显的个体差异和遗传倾向B．可有即刻相和延缓相反应C．特异性IgE参与D．免疫病理作用以细胞破坏为主E．发生和消退迅速18．与Ⅱ型超敏反应无关的成分是:（）A．补体B．抗体C．巨噬细胞D．嗜酸粒细胞E．NK细胞19．细胞免疫是由（）介导的。
医学免疫学：溶血空斑试验(PFC测定)
• 实验目的：
1. 掌握PFC试验的基本原理及实验方 法；
2. 了解PFC试验的临床意义。
实验原理
➢ 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 ➢ 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
实验材料
• 小鼠18～22g， • 5％、15％SRBC，补体，Hank’s液， • 解剖器械（剪刀、镊子）， • 空平皿、筛网、组织研磨器、吸管、试管、离心
机， • 载玻片、双面胶、微量加样器、Tip头、棉签、石
蜡、石蜡锅、温箱等。
1.脾细胞悬液的制备
5％ SRBC 0.4ml腹腔内注射免疫小鼠
实
验
4d后
流பைடு நூலகம்
颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，放入已加8ml Hank’s液的平皿中，研磨，200目筛网过滤
程
离心：1000r/min×10min
去上清，加2ml Hank’s液制成脾细胞悬液
2.制作小室
取洁净载玻片两张
实
验
用双面胶在中间和两端各粘一条，将
流
两张玻片黏在一起即成2个小室
程
3.配制小室灌注液
准备2支试管，按照下表加样：
实 验 脾细胞悬液 流 15%SRBC 程 补体
实验管（μl） 对照管 （μl）
100
100
100
100
100
-
Hank’s液
500
600
混匀，分别灌注小室（注满），石蜡封口，
溶血空斑试验（PFC测定）
(Plaque forming cell assay)
小鼠B细胞溶血空斑形成试验
➢ 溶血空斑试验是基于抗原抗体反应可活化补体， 溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外 试验方法，用于检测动物的抗体产生功能的经典 的试验。
免疫检验考试辅导：B细胞功能检测
1.空斑形成细胞（plaque formingcell，PFC）检测是体外检测B细胞功能的一种方法。
该法最早用于实验动物的PFC测定。
是以SRBC作为抗原免疫小鼠，从免疫小鼠脾脏分离淋巴细胞或直接用脾细胞，将其与高浓度SRBC混合于琼脂中，经37℃，5%CO2温育后，在补体参与下抗体形成细胞周围的SRBC溶解而形成溶血小区，即溶血空斑（plaque）。
一个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量表示抗体形成细胞的多少。
IgM参与本反应，固定补体能力强，可直接激活传统途径，导致SRBC溶解，称直接法。
若检测其他类别免疫球蛋白的抗体形成细胞，需在试验系统中加入相应的第二抗体才能使SRBC 溶解形成空斑，称间接空斑形成试验。
近年来，已应用SPA致敏的SRBC结合抗人球蛋白来检测人的抗体形成细胞，此法称SPA-SRBC溶血空斑试验。
在此检测系统中加入抗人Ig，能与受检细胞产生的Ig结合成复合物，并通过复合物中抗人IgFc段与致敏SRBC上的SPA结合，激活补体而使SRBC溶解。
空斑形成细胞的检测，有助于免疫应答动力学的研究和探讨药物对机体免疫状态的影响。
是目前研究B细胞抗体产生功能的重要手段。
2.定量溶血分光光度法（quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS）该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白（以吸光值表示），从而反映机体的体液免疫功能。
试验时，将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。
3.ELISA-空斑试验（ELISA-plaque assay）又称酶联免疫斑点试验（enzyme linked immunospot，ELISPOT）。
该法与ELISA不同之处是，加入的待检标本是细胞，而非可溶性物质；所使用的底物可形成不溶性终产物。
溶血空斑实验的原理
溶血空斑实验的原理1.实验原理：溶血空斑实验主要基于抗原和抗体之间的免疫反应。
当免疫系统受到感染或免疫原刺激时，抗体将与抗原结合，形成免疫复合物。
在溶血空斑实验中，将已知浓度的抗体与红细胞溶菌素处理的红细胞混合，然后加入琼脂糖琼脂培养基中，使混合物凝固。
在凝固过程中，溶菌素溶解琼脂糖，形成无菌区域，也就是空斑。
抗体与抗原结合后，免疫复合物被固定在空斑上。
2.溶血空斑的形成：溶血空斑的形成是通过抗原抗体反应导致的。
在实验中，抗原通常是从被测物中提取的细菌、病毒或其他病原体的产物，抗体则是抗生素和其他免疫反应生成的。
当抗原与抗体结合时，它们组成了免疫复合物。
这些复合物随后被固定在琼脂糖琼脂培养基中，形成圆形的空斑。
3.抗原抗体反应的强度：空斑的大小和数量取决于溶血抗原抗体反应的强度。
当抗体与抗原结合时，抗原抗体复合物会激活补体系统，引发溶血反应。
补体系统的活化会导致细胞膜的破坏，从而使红细胞溶解。
溶血反应越强烈，空斑越大。
因此，通过观察空斑的大小和数量，可以定量评估抗原抗体反应的溶血效应。
4.实验步骤：（1）制备琼脂糖琼脂培养基：将琼脂糖溶于琼脂基础培养基中，使其凝固。
（2）制备抗原抗体混合物：将已知浓度的抗体与红细胞溶菌素处理的红细胞混合。
（3）将抗原抗体混合物加入琼脂糖琼脂培养基中，使其固化。
（4）放置琼脂糖琼脂培养基在适宜的条件下孵育，并观察空斑的形成和大小。
（5）使用计数板或计算机软件，记录并计算空斑的数量和大小。
溶血空斑实验在免疫学研究中具有重要应用，可以被用于评估抗原抗体反应的强度和效果。
通过该实验，可以识别和定量分析具有溶血活性的物质，例如细菌外毒素、补体系统中的抗体和病毒。
它也可用于评估药物或化合物的溶血活性，以及观察疫苗的保护性能力。
总之，溶血空斑实验为研究和评估免疫反应中的溶血效应提供了重要的定量工具。
溶血素实验方法详解
溶血素、溶血空斑实验方法[试验目的]：溶血素：经鸡红细胞免疫的小鼠可由其淋巴细胞产生一种特异性循环抗体——溶血素（Igm），与鸡红细胞一起体外温育，在补体参与下，可产生溶血反应。
致敏小鼠血清中的溶血素的含量可通过溶血过程中释放的血红蛋白来检测。
后者可直接或与都氏液反应形成氰化血红蛋白后比色测定。
溶血空斑：抗体形成细胞数可根据分泌的Igm抗体固定补体后溶解指示红细胞数量来反应，即将鸡红细胞免疫的小鼠脾制成细胞悬液与一定量的鸡红细胞混合，在补体的参与下，使抗体分泌细胞周围的鸡红细胞溶解，测定溶血OD值，从而定量测定抗体形成细胞所分泌的抗体。
[试验材料]：1．动物：KM远交系小鼠、土公鸡（青龙场农茂市场）2．受试物3．阳性对照药：左旋咪唑、环磷酰胺4．试剂：A、阿氏液：NaCl 4.2g 二水柠檬酸钠8.0g 柠檬酸0.5g无水葡萄糖18.7g ( 或有水葡萄糖20.6g)，溶于新鲜蒸馏水1000ml，分装成若干瓶，高压来菌（10p\115℃,20~30min）备用。
B、血红蛋白测定试剂盒（HiCN法）：四川迈克科技有限责任公司，代替都氏液。
C、Gey’s液：NH4Cl 7g Tris(mw121.4) 2.4g 溶于1000ml超纯水。
稀盐酸（1：36）调PH=7.2，（一般配1000ml 约需18ml稀盐酸）D、5%鸡红血球：健康公鸡翅下向远血端进针取静脉血约20ml于预先灭菌的阿氏液中，一般5~10ml血/瓶；取其中一瓶，生理盐水洗涤3次，每次3000rpm，10min,末次所得的红细胞在刻度离心管中定容后，加入19倍生理盐水配制成5%。
（一般5ml血可洗出血细胞约2~3ml）。
免疫小鼠用，用时ip0.2ml/只。
E、4%鸡红血球：取血、洗涤方法同5%鸡红血球。
定容后加入24倍生理盐水配制而成。
F、0.2%鸡红血球：将4%鸡红血球稀释20倍，即2.5ml 4%鸡红血球加生理盐水60ml。
G、10%豚鼠血清：豚鼠心脏取血，分离血清，定容后加入9倍生理盐水即成。
溶血空斑实验..
（四）加补体 • 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰 箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处， 用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑 的溶血状况，并记录整个平皿中的 空斑数，同时求出每百万个脾细胞 内含空斑形成细胞的平均数。
●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B
细胞 ），空斑的数量反映机体的体液 免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的 多少。由于溶血空斑试验具有特异性高， 筛选力强，可直接观察等优点，故可用 做判定免疫功能的指标，观察免疫应答 的动力学变化，并可进行抗体种类及亚 类的研究。
实验材料与试剂
• 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微 镜 • 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS 离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用 PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度 为2.00×109个/mL
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）： 将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种 浓度。将表层基分装于小试管中，每管 2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬 液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小 鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS 中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊 子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中， 2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS 液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为 5×106个/ml）
经典溶血空斑实验的原理
经典溶血空斑实验的原理经典溶血空斑实验是一种常用于研究溶血现象的实验方法。
其原理是通过控制不同浓度的溶血试剂与红细胞悬液反应，观察溶血现象的发生情况，从而了解溶血试剂的溶血效果。
下面列举了经典溶血空斑实验的原理：1. 溶血现象：红细胞在一定条件下受到破坏，导致红细胞内部的血红蛋白溶解出来，形成溶血现象。
2. 溶血试剂：溶血试剂是一种具有溶解红细胞膜的特性的物质，常用的溶血试剂有生理盐水、蒸馏水、酸、碱等。
3. 红细胞膜：红细胞膜是红细胞的外层膜，由磷脂、蛋白质和糖组成，具有一定的韧性和弹性。
4. 溶血试剂与红细胞膜的作用：溶血试剂能够破坏红细胞膜，使血红蛋白溶解出来。
5. 溶血程度的测定：通过观察红细胞悬液与溶血试剂反应后形成的溶血空斑的大小和数量，来判断溶血程度的大小。
6. 溶血空斑的形成：红细胞悬液与溶血试剂反应后，红细胞膜受到破坏，血红蛋白溶解出来形成空斑。
7. 溶血空斑的观察：溶血空斑呈现出透明的圆形区域，周围是红色的红细胞残片。
8. 溶血程度的判断：溶血程度的大小可以通过观察溶血空斑的大小、数量和形状来判断，溶血程度越大，空斑越大、数量越多。
9. 溶血试剂浓度的影响：溶血试剂的浓度越高，其溶血效果越强，溶血程度越大。
10. 环境因素的影响：温度、pH值等环境因素也会影响溶血试剂对红细胞的溶血效果。
11. 应用范围：经典溶血空斑实验可以用于检测溶血性贫血、溶血性疾病等，也可以用于研究溶血机制和溶血试剂的效果。
经典溶血空斑实验是一种简单、直观的实验方法，通过观察溶血空斑的形成和溶血程度的大小，可以初步评估溶血试剂的溶血效果。
这种实验方法广泛应用于临床医学、生物医学研究及药物研发领域，对于研究溶血机制和溶血性疾病的发生发展具有重要的意义。
体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce
体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。
是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。
自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。
特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。
它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。
它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。
溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。
前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。
因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。
至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。
小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。
目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。
其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。
一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。
实验二溶血空斑
实验二溶血空斑实验目的：了解血液抗原与抗体的作用，掌握血凝反应的基本原理和实验方法，了解溶血空斑试验的原理，探讨影响溶血空斑的因素。
实验原理：人和动物的血液表面都有各种化学物质，其中最明显的有抗原和抗体。
血型抗原通常是在红细胞的表面，而血型抗体则在血清中。
在正常情况下，抗原与抗体之间不会产生相互作用，但是在体外与不同类型的血液混合时就会出现反应。
在血凝反应过程中，当同种抗体与同种抗原相遇时，它们会结合起来形成一个可见的团块。
抗体对于外来抗原有着高度的选择性，即其能够选择性的结合到特定的抗原，而不涉及其他抗原类型。
通常存在四种血型：A、B、AB、O。
每一种血型都有特定的抗体和抗原。
溶血是指红细胞破裂释放出细胞内物质的过程。
红细胞的膜结构具有半渗透性，并且固定量的抗体或淀粉样物质能与它们结合。
当不兼容的血液混合时，体内的抗体结合到血型抗原表面，从而导致血细胞的破裂和血液中出现游离的血红蛋白，也称为溶血现象。
溶血空斑试验是一种检测抗体特异性和浓度的试验。
在试验中，试管中的血浆加入已知抗原类型的红细胞悬液，然后让其稀释，最终加入悬液的红细胞浓度足以产生溶血空斑。
抗体与相应抗原结合时会在红细胞表面形成网状结构，称为空斑。
空斑在显微镜下呈现为圆形透明的结构，其大小和数量取决于抗体浓度和特异性。
抗体浓度越高，抗体与红细胞结合的位置越小，空斑越大。
实验步骤：设计课题：本实验选择 ABO 血型系统，探究不同抗体浓度对溶血空斑的影响。
器材：平滴管5ml，离心机，显微镜，石蜡片，波茨玻璃吸管，无菌吸球，超声波清洗器。
试剂：离心管，血型鉴定血清（A、B、O）、丙酮、0.9％生理盐水、0.3％凝血酶液、4％牛血清蛋白、洗涤缓冲液。
操作流程：1.实验器材的清洗：取下一个 50 毫升的玻璃容器，加入浓度为 10% 的氢氧化钠溶液，用玻璃棒搅拌，再洗净，然后反复用蒸馏水洗净。
之后，使用超声波清洗器清洁吸球。
将使用密闭器前的所有仪器和试剂清洗，使其无残留物和干净。
一种简便的PFC测定法
一种简便的PFC测定法
宁耀瑜;陈鸣;张明安
【期刊名称】《广西医科大学学报》
【年(卷),期】1993(0)4
【摘要】溶血空斑试验是体外测定 B 淋巴细胞的一种方法,具有灵敏、特异性强等特点。
传统的玻片小室法必须经过制作玻片小室这一琐碎繁杂步骤,且在空斑测定中易形成气泡而影响结果。
为此,我们对它进行了改良,用血细胞计数板作为培养小室,其效果明显优于玻片小室法。
另外。
【总页数】2页(P435-436)
【关键词】溶血空斑试验;血细胞计数板;小室法;体外测定;特异性;PFC;SRBC;肺冲洗液;脾细胞;淋巴细胞功能
【作者】宁耀瑜;陈鸣;张明安
【作者单位】广西医学院病理生理学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R
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(Plaque forming cell assay)
小鼠B细胞溶血空斑形成试验
➢ 溶血空斑试验是基于抗原抗体反应可活化补体， 溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外 试验方法，用于检测动物的抗体产生功能的经典 的试验。
➢ 将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一 定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体产生细 胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空 斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。
机， • 载玻片、双面胶、微量加样器、Tip头、棉签、石
蜡、石蜡锅、温箱等。
1.脾细胞悬液的制备
5％ SRBC 0.4ml腹腔内注射免疫小鼠
实
验
4d后
流
颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，放入已加8ml Hank’s液的平皿中，研磨，200目筛网过滤
程
离心：1000r/min×10min
去上清，加2ml Hank’s液制成脾PFC试验的基本原理及实验方 法；
2. 了解PFC试验的临床意义。
实验原理
➢ 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 ➢ 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
实验材料
• 小鼠18～22g， • 5％、15％SRBC，补体，Hank’s液， • 解剖器械（剪刀、镊子）， • 空平皿、筛网、组织研磨器、吸管、试管、离心
2.制作小室
取洁净载玻片两张
实
验
用双面胶在中间和两端各粘一条，将
流
两张玻片黏在一起即成2个小室
程
3.配制小室灌注液
准备2支试管，按照下表加样：
实 验 脾细胞悬液 流 15%SRBC 程 补体
实验管（μl） 对照管 （μl）
100
100
100
100
100
-
Hank’s液
500
600
混匀，分别灌注小室（注满），石蜡封口，
37度，40min.
实验组
对照组
结果：
实验组出现无数个透明的溶血空斑，而对照组无。 溶血空斑边缘不规则，而气泡透亮、边缘规则。
实验组
对照组
气泡 空斑
B细胞 浆细胞
• 【注意事项】 1.灌注时防止气泡的出现。