溶血素实验方法详解

溶血素、溶血空斑实验方法

[试验目的]：

溶血素：经鸡红细胞免疫的小鼠可由其淋巴细胞产生一种特异性循环抗体——溶血素（Igm），与鸡红细胞一起体外温育，在补体参与下，可产生溶血反应。致敏小鼠血清中的溶血素的含量可通过溶血过程中释放的血红蛋白来检测。后者可直接或与都氏液反应形成氰化血红蛋白后比色测定。

溶血空斑：抗体形成细胞数可根据分泌的Igm抗体固定补体后溶解指示红细胞数量来反应，即将鸡红细胞免疫的小鼠脾制成细胞悬液与一定量的鸡红细胞混合，在补体的参与下，使抗体分泌细胞周围的鸡红细胞溶解，测定溶血OD值，从而定量测定抗体形成细胞所分泌的抗体。

[试验材料]：

1．动物：KM远交系小鼠、土公鸡（青龙场农茂市场）

2．受试物

3．阳性对照药：左旋咪唑、环磷酰胺

4．试剂：

A、阿氏液：NaCl 4.2g 二水柠檬酸钠8.0g 柠檬酸0.5g

无水葡萄糖18.7g ( 或有水葡萄糖20.6g)，溶于新鲜蒸馏水1000ml，分装成若干瓶，高压来菌（10p\115℃,20~30min）备用。

B、血红蛋白测定试剂盒（HiCN法）：四川迈克科技有限责任公司，代替都氏液。

C、Gey’s液：NH4Cl 7g Tris(mw121.4) 2.4g 溶于1000ml超纯水。稀盐酸（1：36）调PH=7.2，（一般配1000ml 约需18ml稀盐酸）

D、5%鸡红血球：健康公鸡翅下向远血端进针取静脉血约20ml于预先灭菌的阿

氏液中，一般5~10ml血/瓶；取其中一瓶，生理盐水洗涤3次，每次3000rpm，10min,末次所得的红细胞在刻度离心管中定容后，加入19倍生理盐水配制成5%。（一般5ml血可洗出血细胞约2~3ml）。免疫小鼠用，用时ip0.2ml/只。

E、4%鸡红血球：取血、洗涤方法同5%鸡红血球。定容后加入24倍生理盐水配制而成。

F、0.2%鸡红血球：将4%鸡红血球稀释20倍，即2.5ml 4%鸡红血球加生理盐水60ml。

G、10%豚鼠血清：豚鼠心脏取血，分离血清，定容后加入9倍生理盐水即成。（一般60只小鼠约需3.5~4ml血清）。

H、10%豚鼠血清（经压积鸡红细胞吸收，空斑实验用）：血清与压积鸡红细胞比例为10：1。若60只小鼠，即需5m;左右血清加入0.5ml压积鸡红血球，震荡混匀后置4℃冰箱，静置30min，然后离心，2000rpm，10min，取上清。用时用生理盐水配成10%。

5．器材：手术剪、镊；匀浆器，小漏斗，100目铜网；刻度离心管（洗鸡红血球用）；5ml一次性注射器（20只左右）；100ml或250nl盐水瓶（分消阿氏液、取鸡血用）；移液器（1～5ml、1ml）；

６．仪器：离心机、电子天平、振荡器、恒温水浴锅、分光光度计

[试验方法]：取健康小鼠，18~22 g，分组后给药。给药当天以5%鸡红细胞混悬液腹腔注射0.2ml/只进行免疫，为第零天（D0）。一般免疫5~7天，补体含量较高，免疫前一天禁食不禁水，免疫最后一天，

1、小鼠称体重

2、小鼠眼眶采血20ul/只，立即加入盛有1ml生理盐水的试管中。采血完毕，

试管中分别加入4%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml和10%豚鼠血清0.5ml，充分混匀。立即置37℃恒温水浴箱中保温。0.5h后取出立即冰浴中以终止反应。待试管冷却后，离心，取上清液1ml,加入3ml都氏液。放置10min后，在540nm 处比色，以都氏液为空白调零，测定各管光密度。

3、小鼠解剖，称脾、胸腺重量，计算脏器指数

4、取脾30mg/只，非纯种动物需相邻两只动物脾混合匀浆，先在匀浆器中加入

约2.5ml gey’s液匀浆，100目铜网过滤，再加入2.5ml gey’s液冲洗匀浆器，过滤；离心洗涤，3000rpm\10mim，吸弃上清液，加入4ml gey’s 液震荡器振荡混匀，制成脾细胞悬液。取脾细胞悬液、0.2%鸡红血球、经鸡红血球吸收的10%豚鼠血清各0.5ml，空白对照管，不加补体（豚鼠血清），作为零管调零。立即置37℃恒温水浴箱中保温1h，离心3000rpm,5min,取上清，波长413nm处比色。