六。淀粉样变的诊断和分型进展李剑.

基于质谱蛋白质组学的淀粉样变分型方法李剑

北京协和医院血液内科

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淀粉样变是一种机制尚不明的系统性疾病●致淀粉样蛋白: 具有反向平行的折

叠二级结构

●伴侣蛋白共沉积

SAP蛋白

ApoE蛋白

Apo A-IV蛋白

●靶器官损害

沉积效应

直接细胞毒作用

疑诊淀粉样变的可能●非糖尿病性肾病综合征●非缺血性的向心性肥厚的心肌病

●不明原因肝大或者胆管酶增高

●周围或自主神经病变

●不可解释的面部或颈部瘀斑或出血

●巨舌

如何诊断?

●病理学诊断

●组织活检中发现均质粉染物质

●刚果红染色阳性

活检部位阳性率

骨髓60%

腹壁皮下脂肪70%

唇腺50%

舌体>80%

受累器官(肾-肝-心> 90%

识别刚果红:荧光vs 偏振光

淀粉样变的类型多样:刚果红染色阳性不够

类型前体物来源治疗AL轻链克隆性浆细胞化疗/ASCT AA血清致淀粉样变蛋白A肝脏原发病治疗SSA野生型甲状腺转运球蛋白肝脏对症处理ATTR突变型甲状腺转运球蛋白肝脏肝移植AFib纤维蛋白原α链肝脏肝移植AApoA1载脂蛋白A1肝脏/小肠肝移植透析相关β2微球蛋白-间断血滤

非AL型并不少见

英国注册登记研究

Mayo诊所的肾脏淀粉样变亚型分布情况, %

AL型vs. M蛋白●有M蛋白+是否就是AL型淀粉样变?

●AL型淀粉样变是否都要有M蛋白+?

AL型淀粉样变绝大部分都有M 蛋白

●血免疫固定电泳(S-IFE

●尿免疫固定电泳(U-IFE

●血清游离轻链比(FLCR

●至少1个阳性

N=133例AL型淀粉样变

M蛋白+ AL 型

心脏淀粉样变性

n=143

ATTR (57%AL (43%

SPEP/IFE/U-IFE+

n=76

AL n=56ATTR

n=20

FLCR+

n=61

AL

n=53

ATTR

n=8

组织内淀粉样变蛋白的鉴定方法

●免疫组化法/免疫荧光法(IHC●免疫电镜荧光法

●已知突变基因的DNA测序

●质谱法

新鲜组织全蛋白质谱

激光显微切割+质谱●假阴性率高

✓316例AL型中只有121例有阳性组化结果✓商品化抗体种类少✓抗体质量影响

✓蛋白构象变化导致抗体结合位点丧失●假阳性率高-缺乏主导蛋白✓组织泛染,κ-λ均阳性

✓标本处理过程中蛋白杂质污染

免疫组化法不再推荐用于AL淀粉样变分型高通量分析

直接显示全部蛋白构成,无需逐一检测各种致病性蛋白

蛋白鉴定不受构象变化影响

鉴定突变型蛋白不依赖于基因检测

利于发现新的致病蛋白种类

激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD/MS 微量蛋白提取

LMD/MS 鉴定亚型有着高特异性和敏感性

N

部位敏感性特异性备注

113神经100%100%部分为IHC 分型失败病例2

41

心脏

98%

100%

IHC 分型成功率为42%321神经100%NA 均为IHC 失败病例。10例ATTR 的LMD/MS 分型

结果与基因检测完全相符4

127

肾脏

96%

NA

大部分为IHC 失败的病例;发现了新亚型ALect2

●福尔马林固定后的石蜡包埋组织回顾性分析

会诊分析无需新鲜组织冻存●

显微切割

准确定位出淀粉样变物质沉积区实现病变与正常组织的准确分离LMD/MS 的方法学优化

蛋白提取质谱前处理质谱结果分析

●最佳的蛋白提取液●微滤膜使用

●微波处理加速流程●emPAI定量蛋白

●P积分& D积分的设定

1.5h

2.5h2h

最佳蛋白提取液的确定

最佳蛋白提取液的确定: 0.2% Zwittergent

肽段数蛋白数谱图数≫2种肽段的蛋白数总的蛋白丰度平均蛋白丰度

质谱结果的解读:利用P积分确定是否为淀粉样变●P-score (% = Σ(emPAI amyloid

×100

Σ(emPAI total

●Σ(emPAI

=致病蛋白emPAI+各种伴侣蛋白emPAI

amyloid

●Σ(emPAI

=所有蛋白的emPAI总和

total

●测定20例确诊淀粉样变vs 18例正常对照标本

•P积分>=5.0:

•诊断淀粉样变的敏感性100%; 特异性83.3%

质谱结果的解读:利用D积分确定是否为何种淀粉样变

●D-score =emPAI1st–emPAI2nd

emPAI1st

●emPAI

=丰度最高的致淀粉样变蛋白的emPAI

1st

●emPAI

=丰度次高的致淀粉样变蛋白的emPAI

2nd

●阳性对照组的D积分=0.32~0.93

•D积分>= 0.3可以确定出丰度最高的致淀粉样变蛋白的致病蛋白PUMCH的LMD/MS研究

●2000年1月至2014年6月期间我院确诊的138例系统性淀粉样变患者有器官肿大和(或器官功能不全的临床表现